авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Изменения пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе

На правах рукописи

ГОРЕЛОВА МАРИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

ИЗМЕНЕНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ

КЕРАТИНОЦИТОВ ИНТЕРФОЛЛИКУЛЯРНОГО

ЭПИДЕРМИСА ВИСОЧНОЙ ОБЛАСТИ

У ЛИЦ МУЖСКОГО ПОЛА В ОНТОГЕНЕЗЕ

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание учной степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2011

Работа выполнена на кафедре гистологии, цитологии и эмбриоло гии медицинского института ФГБОУ ВПО "Орловский государствен ный университет" и в Научном отделе ЗАО Фармацевтическое научно производственное предприятие "Ретиноиды"

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Ноздрин Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Яглов Валентин Васильевич доктор медицинских наук Боронихина Татьяна Владимировна Ведущее учреждение: ГБОУ ВПО "Московский государственный медико стоматологический университет"

Защита диссертации состоится "_"_2011 года в _12.00часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 при Учреждении Рос сийской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН по адресу: 117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения РАМН НИИ морфологии человека РАМН

Автореферат разослан "_"_ 2011 г.

Учный секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Михайлова Лилия Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Общий план строения эпидермиса на уровне световой и электронной микроскопии у экспериментальных животных и человека опи сан достаточно полно, что нашло отражение в монографиях и оригинальных работах последних десятилетий (Смирнова И.О., 2005;

Мяделец О.Д. и др., 2006;

Ноздрин В.И. и др., 2008;

Bhattacharyya T.K. et al., 2004;

Dayan N., 2008). Вместе с тем, многие детали, важные в фундаментальном и особенно в прикладном отношениях, ещ нуждаются в углублнном изучении. Так, на пример, остаются малоизученными расовые, половые и региональные осо бенности строения кожи в возрастном аспекте. В предыдущих исследованиях подробно изучены особенности реактивных изменений кожи в ответ на воз действие температурных факторов, влажности, ультрафиолетового облуче ния и проч. (Москалев А.А., 2008;

Скиба М.Н., 2008;

Снарская Е.С., 2011;

Fisher G.J. et al., 2002;

Baumann L., 2007;

Krutmann J., 2010). Однако в этих работах не делается акцент на особенностях строения интерфолликулярного эпидермиса, эпителия волосяных воронок, устьев потовых желз и др. Про должают оставаться актуальными вопросы строения кожи в антенатальном и постнатальном онтогенезе у животных и человека. Недостаток фундамен тальных знаний по этим вопросам не позволяет объективно оценивать актив ность дерматотропных лекарственных препаратов, что в конечном счте не гативно сказывается на рекомендациях по их применению. В практику гисто логических исследований последних лет входят методы идентификации ядерных и цитоплазматических макромолекул с помощью моноклональных антител. Преимуществом таких методов является точность выявления этих соединений, так как моноклональные антитела отличаются высокой специ фичностью и селективно выявляют антигены с известной локализацией, функцией и молекулярным строением. Использование моноклональных ан тител позволяет по-новому взглянуть на устоявшиеся факты и концепции, дат возможность получить аргументы для новых предположений, способст вует расширению знаний, как фундаментальных, так и прикладных. Вс это делает актуальным дальнейшее изучение структурных элементов кожи чело века с учтом е возрастных, половых и региональных особенностей с ис пользованием доказательных методов исследования, таких как иммуногисто химия и морфометрический анализ. Учитывая вышесказанное, были сформу лированы цель и задачи настоящей работы.

Цель исследования. Целью настоящей работы стало выявление изме нений пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликуляр ного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

Задачи исследования 1. Изучить изменение толщины интерфолликулярного эпидермиса ви сочной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

2. Изучить изменение содержания Ki-67-позитивных клеток (маркр пролиферации) в интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

3. Изучить изменение содержания р53-позитивных клеток (маркр по вреждения ДНК) в интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

4. Изучить толщину пласта инволюкрин-позитивных клеток (маркр терминальной дифференцировки) в интерфолликулярном эпидермисе височ ной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

Положения диссертации, выносимые на защиту. Пролиферация и дифференцировка интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе претерпевает определнные изменения. 1. Изме няется его толщина – у плодов и новорожднных эпидермис тонкий, к 19– 21 годам он постепенно утолщается, далее его толщина не изменяется до 40– 45 лет, а к старческому возрасту эпидермис истончается. 2. Изменяется про лиферативная активность кератиноцитов – начиная с антенатального периода развития происходит постепенное увеличение количества Ki-67-позитивных клеток, максимальное число клеток, меченных МКА к белку Ki-67, в эпидер мисе достигается к 19–21 годам жизни. Оставаясь приблизительно на одном уровне до 45 лет, к 75 годам количество Ki-67-позитивных клеток уменьша ется. 3. Содержание клеток с поврежднной ДНК (апоптотические клетки) нарастает с возрастом, при этом первый максимум содержания р53 позитивных клеток выявляется в 19–25 лет. Проявление второго максимума экспрессии белка р53 наблюдается в возрастном интервале 66–75 лет. 4. Экс прессия кератиноцитами белка терминальной дифференцировки – инволюк рина – с возрастом существенно не изменяется.

Научная новизна. Впервые с использованием моноклональных анти тел – маркров основных процессов гистогенеза, таких как пролиферация и дифференцировка, на аутопсийном материале прослежены изменения интер фолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онто генезе. Показано, что толщина эпидермиса и его пролиферативная актив ность одновременно нарастают до 19–21 года и в дальнейшем постепенно снижаются. Количество клеток с поврежднной ДНК увеличивается к 19– 25 годам и резко возрастает после 60 лет. Терминальная дифференцировка кератиноцитов с возрастом существенно не меняется.

Практическая значимость. Полученные результаты используются в гистофармакологических исследованиях при оценке эффективности новых лекарственных средств кожного действия, в морфологической диагностике заболеваний кожи, а также в учебном процессе при преподавании курса гис тологии по специальности "Лечебное дело" и "Педиатрия".

Внедрение. По результатам исследования написаны методические ре комендации: "Окраска гистологических препаратов с помощью монокло нальных антител к Ki-67", "Окраска гистологических препаратов с помощью моноклональных антител к р53", "Окраска гистологических препаратов с по мощью моноклональных антител к инволюкрину" и "Окраска биопсийного материала кожи человека с помощью моноклональных антител к Ki-67". Ре комендации внедрены в Научном дерматологическом центре и Научном от деле Фармацевтического научно-производственного предприятия ЗАО "Ре тиноиды". На кафедру гистологии, цитологии и эмбриологии медицинского института ФГБОУ ВПО "Орловский государственный университет" передано 80 гистологических препаратов кожи височной области лиц мужского пола в возрасте 9 месяцев, 13, 19 и 74 лет, окрашенных гематоксилином и эозином, для преподавания курса гистологии по специальностям "Лечебное дело" и "Педиатрия".

Апробация. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XVII и XVIII Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, апрель 2010 г., апрель 2011 г.), на X Конгрессе Международной ас социации морфологов (Ярославль, сентябрь 2010 г.), на VIII Всероссийской научной конференции "Бабухинские чтения в Орле" (Орл, июнь 2011г.), на Межлабораторной конференции НИИ морфологии человека РАМН (Москва, сентябрь, 2011), на III Эмбриологическом симпозиуме "ЮГРА-ЭМБРИО 2011" (Ханты-Мансийск, октябрь 2011 г.), на Всероссийской научной конфе ренции "Регенеративная биология и медицина" (Москва, октябрь 2011 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них ста тей в журналах по списку ВАК – 3.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов "

Общая характеристика работы

", "Обзор литературы", "Материал и методы", "Результаты собственных исследований", "Обсуждение результатов собст венных исследований", "Выводы", "Стандартные операционные процедуры" и "Литература". Написана на 137 стр., включает 4 таблицы, 46 рисунков, в их числе 25 микрофотографий. Список литературы содержит 205 источника, в том числе 121 иностранный.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Материал. Объектом исследования была аутопсийная кожа височной области волосистой части головы субъектов мужского пола в возрасте от 23 недель антенатального и до 75 лет постнатального развития. Участок кожи височной области размером 1х1 см забирали по линии разреза мягких тканей головы не позднее 12–14 ч после наступления смерти. Всего собрано 120 об разцов. Кусочки фиксировали в забуференном (pH=7,4) 10 % нейтральном формалине. Аутопсийные образцы не брали у лиц, страдавших при жизни со гласно данным протокола судебно-медецинского и патологоанатомического вскрытия заболеваниями кожи, сахарным диабетом и др. Образцы, принад лежащие умершим одного возраста, объединяли с формированием возрас тных "точек" (всего 53) с определением для каждой из них среднего значения и стандартной ошибки изученных параметров. Собранный материал объеди няли также в возрастные группы с интервалом периодизации в 5 лет.

Методы. Гистологическая техника. Фиксированный материал обезво живали путм постепенного проведения через спирты возрастающей концен трации. Материал заливали в Histomix (БиоВитрум, Россия) – среду, содер жащую парафин и пластификаторы. Парафиновые срезы толщиной 4–5 мкм изготавливали на санном микротоме Microm HM 400 R (Carl Zeiss, Герма ния). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методи ке, заключали в канадский бальзам и изучали с помощью светового микро скопа Axiostar 2 (Carl Zeiss, Германия).

Методика измерения толщины интерфолликулярного эпидермиса.

Толщину интерфолликулярного эпидермиса до рогового слоя измеряли в мкм на аппаратно-программном комплексе «ДиаМорф» (ДиаМорф, Россия).

Морфометрические исследования проводили с помощью программы Image Tool (University Texas, США), которая калибровалась объект-микрометром ОМП с ценой деления 0,01 мм. Измерение толщины клеточного эпидермиса проводили в одном срезе кожи каждого аутопсийного образца по вертикали от базальной мембраны;

в поле зрения микроскопа делали по 3 измерения (об. 20, всего 16–18 полей зрения на стекло). По результатам измерения вычисляли среднее значение со стандартной ошибкой.

Иммуногистохимический метод выявления белка Ki-67. Парафиновые срезы кожи расправляли на водяной бане, помещали на предметные сткла с полизиновым покрытием (Menzel, Германия) и сушили в термостате при температуре 37 С в течение 2–3 недель. Белок Ki-67 выявляли с помощью двойного непрямого метода окрашивания антител с использованием поли мерной системы детекции. Депарафинирование, регидратацию и демаски ровку антигенов проводили кипячением срезов в течение 10 мин под повы шенным давлением в растворах Trilogy (Cell marque, США). Применяли мо ноклональные антитела к Ki-67 (clone SP6), выпускаемые той же фирмой, ко торые наносили на срезы в разведении 1:500 с последующей инкубацией во влажной камере в термостате при 37 С в течение 1 часа. Визуализацию Ki 67-позитивных клеток проводили с помощью полимерной системы Histofine Simple DAB-3S kit (3,3-диаминобензидин) (Multi) (Nicherei biosciences, Япо ния). Срезы докрашивали гематоксилином Караччи и заключали в канадский бальзам. Качество проведнной реакции оценивали путм сравнения с пози тивным контролем для антигена.

Особенности иммуногистохимического метода выявления белка р53.

Для визуализации белка р53 использовали МКА к р53 (clone DO7) и AEC So lutio 3-амино-9-этилкарбазол (Nicherei biosciences, Япония). Препараты за ключали в водорастворимую среду UltraMount Plus (LabVision, США).

Особенности иммуногистохимического метода выявления белка инво люкрин. При окраске МКА к инволюкрину (clone SY5) депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов проводили кипячением срезов в те чение 8 мин под повышенным давлением в растворах Decler (Cell marque, США).

Методика подсчта Ki-67- и p53-позитивных клеток. В каждом поле зрения светового микроскопа при об. 100, ок. 10 считали общее количе ство клеток (в базальном и шиповатом слоях), а также количество клеток, меченных МКА к белкам Ki-67 и р53 отдельно для базального слоя эпидер миса, нижней части шиповатого –"супрабазального" слоя и всех пластов ши поватого. Ростковым считали слои в которых выявлялись Ki-67-позитивные клетки;

это были базальный и все пласты шиповатого. Вычисляли в процен тах индексы Ki-67- и р53-позитивных клеток. По результатам измерения для каждого случая вычисляли среднее значение со стандартной ошибкой.

Методика подсчта инволюкрин-позитивных клеток. Для получения цифровых характеристик экспрессии инволюкрина в эпидермисе измеряли (мкм) толщину пласта позитивно окрашенных клеток. По результатам изме рения вычисляли среднее значение со стандартной ошибкой и долю инво люкрин-позитивного пласта в общей толщине клеточного эпидермиса.

Обоснование выбора методов статистического анализа. При выборе критериев статистической оценки учитывали тип распределения (нормаль ный/ненормальный), тип показателя (качественный, количественный, поряд ковый), число сравниваемых групп/точек и количество вариантов выборки (n). При нормальном распределении использовали t-критерий Стьюдента. Ес ли распределение было ненормальным и/или же n 30, но 3, достоверность рассчитывали по непараметрическому методу – U-критерию Манна–Уитни.

В работе использовали также коэффициент корреляции Спирмена (rs). Для определения направления возрастных изменений эпидермиса по коэффици енту детерминации была избрана полиномиальная линия тренда 6-й степени, которую строили в программе Microsoft Office Excel 2007. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «Statistica», версия 6.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изменение толщины интерфолликулярного эпидермиса височной облас ти у лиц мужского пола в онтогенезе. Интерфолликулярный эпидермис ви сочной области у лиц мужского пола представлен многослойным плоским ороговевающим эпителием, состоящим из базального, шиповатого, зернисто го и рогового слов. В антенатальном периоде на 23-й и 25-й неделях разви тия он представлен чтко выраженным слоем базальных кератиноцитов, 1– 2 пластами шиповатого слоя и слабо выраженным зернистым слоем клеток. К 32-й и 40-й неделям внутриутробного развития базальный и зернистый слои остаются такими же, шиповатый слой утолщается и он представлен 2– 3 пластами полигональных клеток (рис. 1 а). К 70- и 78-му дням после рож дения количество кератиноцитов в шиповатом слое возрастает, прослежива ются единичные, слабо выраженные гребешки. К 92-му дню изменения за трагивают только зернистый слой, в цитоплазме клеток которого на всм протяжении гистологического препарата выявляются базофильно окрашен ные гранулы кератогиалина. В дальнейшем происходит постепенное увели чение клеточной популяции кератиноцитов, эпидермальные гребешки стано вятся более выраженными. К 19–21 годам количество клеток шиповатого слоя значительно увеличивается, эпителиальный пласт кожи достигает мак симальной толщины, зернистый слой образован несколькими пластами кле ток с отчтливыми гранулами кератогиалина в цитоплазме, эпидермальные гребешки хорошо выражены и глубоко внедряются в дерму (рис. 1 б). В про межутке от 25 до 45 лет толщина эпидермиса изменяется незначительно, ос таваясь приблизительно постоянной. В дальнейшем эпидермис постепенно истончается, преимущественно за счт уменьшения числа клеток шиповатого слоя;

глубина внедрения гребешков в сосочковый слой дермы уменьшается, линия контакта эпидермиса с дермой сглаживается. Зернистый и роговой слои у лиц зрелого и пожилого возраста развиты слабо (рис. 1 в). Морфомет рическая оценка интерфолликулярного эпидермиса изучаемых образцов по казала, что с 23-й недели внутриутробного развития толщина его клеточной части постепенно нарастает до 20-летнего возраста постнатального развития, после чего отмечается устойчивая, хотя и неравномерно выраженная, тен денция к его истончению. Из графического материала (рис. 2) следует, что от рождения до 16–20 лет эпидермис утолщается. В возрастном периоде 25– 45 лет толщина его приблизительно остатся на одном уровне и в дальней шем постепенно снижается. Итак, в онтогенезе человека толщина интерфол ликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола изменяется следующим образом: у плодов, новорожднных и грудных мальчиков эпи дермис тонкий, он постепенно утолщается к 19–21 годам, остатся неизмен ным до 40–45 лет и вновь истончается к старческому возрасту.

Некоторые конкретные сведения о толщине эпидермиса кожи волоси стой части головы у человека мы нашли в следующих публикациях. Так, в кандидатской диссертации Е.А. Загорученко (1954), выполненной на аутоп сийном материале от лиц мужского пола в возрасте от первых дней жизни Эп Эп Д Д б а Рис. 1. Фрагменты кожи височной области плода на 40-й неделе развития (а), юноши 19 лет (б) и мужчины Эп 74 лет (в). Эп – эпидермис, Д – дерма.

Окр. – гематоксилин и эозин.

Д в до 82 лет, отмечено, что в коже волосистой части головы эпителиальные гре бешки достигают максимального развития к 18 годам и в дальнейшем под вергаются инволюции. Ростковый слой эпидермиса, по данным этого автора, наиболее тонким оказался у новорожднных;

к 25 годам он увеличивался вдвое и после 50 лет истончался. С этими данными согласуются результаты исследования И.Г. Железникова (1958), который показал, что у детей эпи дермис в теменной области утолщается от периода новорожднности до 7 лет более чем в 3 раза. Некоторые сведения об изменении толщины эпидермиса височной области кожи (в основном, у женщин) в возрастном аспекте можно найти в работе И.О. Смирновой (2004), которая установила, что после 19 лет пласт кожного эпителия проявляет тенденцию к истончению.

И.И. Подвысоцкая (1975) изучила 1500 образцов кожи из 18 областей от 30 новорожднных, 10 детей в возрасте от года до 10 лет, 10 человек в период полового созревания, 40 взрослых и 20 лиц пожилого и старческого возраста.

Автор отмечает, что в эпидермисе с возрастом развиваются и прогрессируют атрофические процессы, и в результате он истончается. Работа основана на данных описательной гистологии;

подтверждения заключений морфометри ческими измерениями в ней нет. В исследовании не указана точная область взятия материала.

Наши данные с использованием морфометрического анализа позволили объективизировать эту закономерность. Следует подчеркнуть, что у лабора торных грызунов эпидермис с возрастом также истончается (Ноздрин В.И. и др., 2006). Из этого следует, что возрастные изменения толщины эпидермиса – это общебиологическая закономерность.

Толщина эпидермиса, мкм плоды 0-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 31-35 36-40 41-45 46-50 51-55 56-60 61-65 66-70 71- Антенатальный период развития Возрастные группы, годы Постнатальный период развития Рис. 2. Толщина клеточного интерфолликулярного эпидермиса височной области кожи мужчин в различных возрастных группах.

Изменение содержания Ki-67-позитивных клеток в интерфоллику лярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

На рис. 3 показаны изменения содержания Ki-67-позитивных клеток в эпите лиально-клеточном пласте кожи височной области волосистой части головы у лиц мужского пола в антенатальном и постнатальном периодах развития. В исследованный временной диапазон с 23-й недели антенатального до 75 лет постнатального развития с увеличением толщины эпидермиса количество пролиферирующих клеток в нм нарастает, достигая своего максимума к 19– 21 годам. В дальнейшем количество меченых клеток в истончающемся ин Эп Эп Д Д б а Рис. 3. Ki-67-позитивные клетки (в овалах) в интерфолликулярном эпи дермисе кожи головы височной облас ти плода на 23-й неделе развития (а), Эп юноши 21 года (б) и мужчины 75 лет (в). Эп – эпидермис, Д – дерма. До краска – гематоксилин.

Д в Индекс Ki-67 в эпидермисе, % плоды 0-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 31-35 36-40 41-45 46-50 51-55 56-60 61-65 66-70 70- Антенатальный период развития Возрастные группы, годы Постнатальный период развития Рис. 4. Индекс Ki-67-позитивных клеток в интерфолликулярном эпидермисе кожи височной области у лиц мужского пола в различных возрастных группах.

терфолликулярном эпидермисе кожи снижается приблизительно в 2 раза (рис. 4).

В результате изучения содержания Ki-67-позитивных клеток в различ ных слоях интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц муж ского пола в онтогенезе установили, что в базальном слое, начиная с 23-й не дели антенатального развития их количество увеличивается до 43 лет постна тального развития с резко выраженным подъмом показателя в 19-летнем возрасте. В период от 44 до 65 лет содержание этих клеток уменьшается. В "супрабазальном" слое максимальное число таких клеток приходится на пе риод от 23-й недели антенатального периода развития до 21 года. В даль нейшем число Ki-67-позитивных клеток уменьшается. В шиповатом слое без учта "супрабазального" количество Ki-67-позитивных клеток невелико и варьирует в течение всего онтогенеза – от 0 до 1 в поле зрения микроскопа;

только в 19-летнем возрасте этот показатель превышал цифру 2. Следует от метить, что в возрасте от 43 до 53 лет количество Ki-67-позитивных клеток было минимально и в дальнейшем увеличивалось незначительно. Содержа ние Ki-67-позитивных клеток в шиповатом слое во время антенатального и постнатального развития практически оставалось на одном уровне на всм протяжении онтогенеза. Оценивая весь ростковый слой (базальный и шипо ватый слои вместе) по содержанию Ki-67, можно отметить, что количество пролиферирующих клеток после рождения увеличивалось до 43-летнего воз раста и в дальнейшем с годами постепенно снижалось.

Итак, пролиферативная активность кератиноцитов зависит от возраста (см. рис. 4): у плодов, новорожднных и грудных мальчиков на фоне увели чения толщины эпидермиса происходит постепенное повышение количества Ki-67-позитивных клеток. К 19–21 годам отмечается максимальное число ке ратиноцитов, меченых МКА к белку Ki-67. Оставаясь приблизительно на од ном уровне до 40–45 лет, в дальнейшем в истончающемся эпидермисе коли чество Ki-67-позитивных клеток уменьшается.

В работах Е.А. Ефимова (1977, 1979) и G.D. Weinstein и др. (1984) для оценки пролиферативной активности эпидермиса использовалась H тимидиновая метка и было установлено, что ускорение регенерации сопро вождается ростом митотической активности кератиноцитов. Первые упоми нания о возможности применения для выявления пролиферативной активно сти тканей моноклональных антител к белку Ki-67 относятся к 1983 году (Gerdes J. et al., 1983). H.E. Knaggs и др. (1998) оценивали пролиферативный пул эпидермиса кожи грудной области и его изменения вокруг акне путм подсчта индекса Ki-67. N.A. Coolen и др. (2010) изучали 21 образец кожи от плодов с 13-й до 22-й недели внутриутробного развития, сравнивая их с об разцами кожи людей в возрасте от 34 до 45 лет. Пролиферативную актив ность эпидермиса в его базальном слое оценивали путм подсчта индекса Ki-67;

при этом обнаружили, что во внутриутробном периоде развития деля щиеся клетки встречаются чаще, чем в постнатальном. Исследователи отме тили, что в 13–14 недель внутриутробного развития значение индекса Ki- было максимальное, к 16–18-й неделям он понижался, с последующим по вышением к 21–22-й неделям.

Сходные данные были получены в отношении эпидермиса заушной и височной областей у женщин 19–64 лет (Смирнова И.О., 2004). A. Gilhar и др. (2004) отмечали, что с возрастом снижается пролиферативная активность.

Изменение содержания р53-позитивных клеток в интерфоллику лярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

На фоне утолщения интерфолликулярного эпидермиса с последующим его истончением количество р53-позитивных клеток в нм с возрастом в основ ном увеличивается (рис. 5).

При послойном подсчте числа р53-позитивных клеток установили, что их содержание в базальном слое эпидермиса относительно невелико. Наи большее количество р53-позитивных клеток содержалось в шиповатом слое.

Их абсолютное число уменьшается до 68 лет с последующим значительным увеличением к 75 годам. В "супрабазальном" слое позитивно окрашенных клеток было меньше, чем в шиповатом слое без учта "супрабазального". В период антенатального развития белок р53 выявлялся преимущественно в "супрабазальном"слое шиповатого слоя, состоящем из 2–3 пластов клеток.

Увеличение представительства меченых клеток после 50 лет идт преимуще ственно за счт повышения их числа в базальном и "супрабазальном" слоях.

Оценивая послойное содержание меченых кератиноцитов, мы сочли целесо образным суммировать все р53-позитивные клетки в базальном и шиповатом слоях и представить результат в виде индекса, указывающего их долю (%) в общем числе клеточных элементов эпидермиса для каждой возрастной груп пы. Индекс р53 с возрастом увеличивался и составил в группе 71–75 лет – 12,4 %.

Эп Эп Д Д а б Рис. 5. р53-позитивные клетки (в овалах) в интерфолликулярном эпи дермисе кожи головы височной облас Эп ти плода на 40-й неделе развития (а), юноши 19 лет (б) и мужчины 74 лет (в). Эп – эпидермис, Д – дерма. Докра Д ска – гематоксилин.

в На рис. 6 представлена полиномиальная линия тренда, отражающая на правление изменения содержания в эпидермисе р53-позитивных клеток с возрастом.

Таким образом, минимальная толщина клеточного эпидермиса в соче тании с низким содержанием Ki-67- и p53-позитивных клеток выявляется в антенатальном периоде развития. К 20 годам эпидермис достигает макси мальной толщины, что сопровождается максимумом его пролиферативной активности и первым повышением содержания р53-позитивных клеток. В более поздние возрастные периоды происходит истончение эпидермиса и снижение уровня пролиферативной активности кератиноцитов с одновре менным увеличением числа p53-позитивных клеток. Следует подчеркнуть, что р53-позитивные клетки встречались в базальном и в основном в "супра базальном" слоях эпидермиса, редко – в верхних пластах шиповатого слоя и никогда – в зернистом и роговом. Это говорит, что процессы апоптоза и тер минальной дифференцировки – это два разных процесса, которые протекают относительно независимо и параллельно друг другу. Необходимо отметить, что МКА к р53 выявляют клетки с поврежднной ДНК. Они могут погибнуть путм апоптоза или, репарировав свою ДНК, вступить в терминальную диф ференцировку.

Индекс р53 в эпидермисе, % плоды 0-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 31-35 36-40 41-45 46-50 51-55 56-60 61-65 66-70 70- Антенатальный период развития Возрастные группы, годы Постнатальный период развития Рис. 6. Индекс p53-позитивных клеток (%) в базальном и шиповатом слоях эпидер миса височной области головы мужчин в различных возрастных группах.

Направление изменений числа р53-позитивных клеток в эпидермисе кожи с возрастом было прослежено в работе M.B. El-Domyati и др. (2003).

Авторы изучали кожу лица, подвергавшуюся солнечному воздействию, и ко жу живота, защищнную от солнца, у людей обоего пола в возрасте от 6 до 77 лет. Обнаружено, что одинаковая доза инсоляции у пожилых сильнее по вреждает ДНК кератиноцитов, чем у молодых, что прямо отражается на со держании в эпидермисе р53-позитивных клеток. Т.Ю. Витрук (2008), Т.Ю. Витрук и др. (2008), оценивая содержание маркров апоптоза в био псийных образцах кожи лица, шеи и груди от 16 женщин в возрасте от 16 до 64 лет, показали, что с возрастом количество клеток, меченных МКА к р возрастает. По нашим данным, примерно к 19–25 годам выявляется первый заметный максимум содержания р53-позитивных клеток. Это вполне понят но, если принять во внимание, что активация белка р53 маркирует клетки с поврежднной ДНК или клетки, разрушающиеся путм апоптоза (Nigro J.M.

et al.,1997;

Chylicki K. et al, 2000;

Raj D. et al., 2006), т. к. чем выше пролифе ративная активность, тем больше вероятность появления клеток с поврежде нием ДНК. Появление второго максимума экспрессии р53 на фоне низкой пролиферативной активности (возрастной интервал 70–75 лет) связано, веро ятно, уже с другими причинами, поскольку известно, что частота появления клеток с поврежднной ДНК с возрастом увеличивается во многих тканях (Чумаков П.М., 2007;

Batinac T. et al, 2004). На графиках, представленных на рис. 7, можно видеть, что изменения пролиферативной активности эпидерми са и содержания в нм р53-позитивных клеток идт параллельно до 50 лет, а после шестидесяти эти процессы приобретают противоположную направлен ность: количество Ki-67-позитивных клеток прогрессивно падает, а р53 позитивных – нарастает. Анализируя эти данные, можно предположить, что в юношеские годы белок р53 преимущественно активирует репарацию повре жднной ДНК, хотя апоптотическая гибель клеток здесь тоже должна иметь место. К пожилому возрасту, клеток с поврежднной ДНК становится боль ше, в основном они гибнут путм апоптоза, однако наличие репарации ДНК в этом возрасте исключить нельзя.

Анализируя результаты настоящего исследования, можно с определн ной долей уверенности утверждать, что терминальная дифференцировка и апоптоз – это разные пути клеточной гибели. Об этом говорит тот факт, что р53-позитивные клетки никогда не встречаются в зернистом и роговом слоях, т.е. там, где протекает процесс терминальной дифференцировки, а не апоп тоз.

Индекс содержания клеток в эпидермисе, % плоды 0-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 31-35 36-40 41-45 46-50 51-55 56-60 61-65 66-70 71- Индекс Ki- Возрастные группы, годы Индекс р Рис. 7. Индекс Ki-67 и р53 в интерфолликулярном эпидермисе кожи височной облас ти у лиц мужского пола в различных возрастных группах.

Изменение инволюкрин-позитивного пласта клеток в интерфолли кулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтоге незе. Клетки, меченные антителами к инволюкрину, располагаются в верх них слоях эпидермиса и образуют инволюкрин-позитивный пласт (рис. 8).

Как показали измерения, толщина пласта инволюкрин-позитивных клеток в эпидермисе с 23-й недели антенатального развития до 75 лет постнатального развития практически не зависит от возраста и колеблется от 11 до 27 мкм.

Как и следовало ожидать, при постоянной абсолютной толщине этого пласта его доля в эпидермисе изменяется в обратной зависимости от величины об щей толщины кожного эпителия. Так, у 11-летнего ребнка она составляет 46,1 %;

у мужчины в возрасте 21 года – 68,1 %;

в 63 года – 95,4 %;

после чего наблюдается незначительное снижение показателя – до 82,6% у мужчин 75 лет (рис. 9).

Таким образом, в интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола пласт терминально дифференцированных клеток, изу ченный на примере инволюкрин-позитивных клеток, в абсолютных величи нах остатся постоянным на протяжении всего онтогенеза, т. е. кожа сохра няет основную свою функцию – барьерную – как в антенатальном, так и в постнатальном периодах развития. При этом доля инволюкрин-позитивного пласта в истончающемся эпидермисе с возрастом увеличивается.

Эп Эп Д Д а б Рис. 8. Пласт инволюкрин позитивных клеток интерфолликуляр ного эпидермиса кожи височной об Эп ласти плода 40-й неделе развития (а), юноши 13 лет (б) и мужчины 74 лет (в). Эп – эпидермис, Д – дерма. До Д краска – гематоксилин.

в Работ посвященных изучению процессов терминальной дифференцировки в интерфолликулярном эпидермисе кожи височной области у мужчин в онто генезе, нам обнаружить не удалось. Однако провести некоторые параллели с двумя исследованиями вс же возможно. Так, в работе T. Tezuka и др. (1994) методами иммуногистохимии было показано, что в юношеские и зрелые го ды в коже лица содержание таких белков терминальной дифференцировки, как филаггрин, инволюкрин и карбоангидразоподобный белок, оставалось неизменным. N.A. Coolen и др. (2010) изучали дифференцировку эпидермиса с помощью маркров к цитокератину 10 и инволюкрину. Согласно их дан ным, с 13–14-й недели внутриутробного периода цитокератин 10 визуализи ровался в промежуточной пластинке и перидерме, с 16-й недели цитокератин 10 выявлялся только в промежуточной пластинке, а в возрасте 34–45 лет – в шиповатом и зернистом слоях. Инволюкрин с 13-й по 22-ю неделю внутри утробного развития присутствовал во всех слоях эпидермиса, кроме базаль ного;

в постнатальном периоде – только в зернистом. С учтом этих данных можно сделать вывод, что способность кератиноцитов формировать эпидер мальный барьер является доминирующей функцией кожи и с возрастом су щественно не изменяется даже при изменении общей толщины эпидермиса.

Толщина пласта инволюкрин-позитивных клеток, мкм 23нед 14 39 Антенатальный период развития Возраст, годы Постнатальный период развития Рис. 9. Толщина инволюкрин-позитивного пласта клеток в эпидермисе кожи ви сочной области у лиц мужского пола в онтогенезе в различных возрастных точках.

В обсуждаемом исследовании обнаружено, что к пожилому и старче скому возрасту у мужчин общая толщина эпидермиса кожи височной облас ти существенно уменьшается. Однако абсолютные значения толщины пласта инволюкрин-положительных клеток, т. е. клеток, вступивших в стадию тер минальной дифференцировки, остаются неизменными и примерно равными тому значению, которое характерно для эпидермиса в юношеские годы. Это обстоятельство может свидетельствовать, что несмотря на низкую скорость клеточного обновления в старческом возрасте (небольшую толщину эпидер миса и низкую пролиферативную активность кератиноцитов) барьерная функция кожного эпителия остатся сохранной. Полагаем, что в старческих возрастных группах клетки раньше вступают в фазу терминальной диффе ренцировки и, очевидно, пропускают ряд промежуточных фаз, характерных для последовательно дифференцирующихся клеток зрелого эпидермиса. Та кое предположение возможно, поскольку, как показали недавние исследова ния, программа терминальной дифференцировки кератиноцитов находится под контролем белков группы polycomb, которые репрессируют ген терми нальной дифференцировки, сохраняя, таким образом, пролиферативный по тенциал клеток базального слоя (Watt F.M., 2006;

Ezhkova E. et al., 2009). По следовательное снятие этой блокады позволяет клеткам вступать на путь терминальной дифференцировки за счт активации транскрипции соответст вующих генов с помощью белков-активаторов. При этом показано, что с воз растом при детерминации клеток к терминальной дифференцировке актив ность группы polycomb существенно уменьшается (Adhikary G. et al., 2004).

Предполагаем также, что поскольку пласт, в котором экспрессируется инво люкрин, выполняет функцию защитного барьера кожи, его сохранение даже в пожилом и старческом возрасте, несмотря на снижение пролиферативной активности эпидермиса, представляется жизненно необходимым.

Взаимосвязь возрастных изменений эпидермиса с уровнем содер жания андрогенов в крови у лиц мужского пола. В литературе имеются сведения о прямой, либо опосредованной стимуляции андрогенами пролифе ративной активности кератиноцитов (Kanda N. et al, 2005;

Seiffert К. et al., 2007). Показана корреляция между общим содержанием тестостерона в крови и количеством эндокриноцитов бульбоуретральных желз у мужчин разного возраста (Боронихина Т.В., 2007). Мы также проделали подобный анализ и получили корреляцию между пролиферативной активностью интерфоллику лярного эпидермиса и уровнем тестостерона в крови (рис. 10). Корреляция составила 0,758, что дат основания полагать, что возрастное истончение эпидермиса у мужчин тесным образом связано с угасанием тестостеронобра зующей функции яичек.

Заключение. Впервые с использованием моноклональных антител, яв ляющихся маркрами основных процессов гистогенеза эпидермиса (проли ферация, дифференцировка, клеточная гибель), на аутопсийном материале прослежены изменения интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе. Толщина клеточного пласта и его проли феративная активность нарастают до 19–21 года и в дальнейшем постепенно снижаются. Пролиферативная активность кератиноцитов коррелирует с воз растными изменениями концентрации тестостерона в крови. Количество кле ток с поврежднной ДНК (апоптотические клетки) увеличивается к 19– 25 годам и резко увеличивается после 60 лет. Терминальная дифференциров ка кератиноцитов с возрастом существенно не изменяется.

16 14 0 0-1 2-7 8-12 13-16 17-21 22-35 36-45 46-60 61-74 75- Возрастные группы, годы Индекс Ki-67 Концентрация тестостерона Рис. 10. Индекс Ki-67 в интерфолликулярном эпидермисе кожи височной области (собственные данные) в сравнении с концентрацией общего тестостерона в крови (по Н.У. Тец, 2003;

цит. по Т.В. Боронихиной, 2007) у лиц мужского пола в различных возрас тных группах. По оси ординат слева – индекс Ki-67,%;

справа – концентрация тестостеро на в крови, нг/дл.

ВЫВОДЫ Толщина интерфолликулярного эпидермиса кожи височной области у 1.

лиц мужского пола изменяется на всм протяжении онтогенеза. Так, начиная с антенатального периода до юношеского возраста, происходит утолщение клеточного пласта. В последующие возрастные периоды наблюдается его по степенное истончение.

Изменение толщины интерфолликулярного эпидермиса, связанное с 2.

интенсивностью пролиферативной активности кератиноцитов, изучено путм определения в нм содержания Ki-67-позитивных клеток. Начиная с 23-й не дели антенатального развития происходит постепенное увеличение количе ства делящихся клеток, к 19–21 годам постнатального развития отмечается максимальная экспрессия белка Ki-67. Оставаясь на одном уровне до 45 лет, к 75 годам количество этих клеток уменьшается.

В онтогенезе содержание клеток с поврежднной ДНК (апоптотиче 3.

ские р53-позитивные клетки) в интерфолликулярном эпидермисе возрастает.

Наблюдается два максимальных значения этого показателя: первое – в 19– 25 лет, второе, более выраженное, – в 66–75 лет.

Барьерная функция эпидермиса, если судить по толщине пласта инво 4.

люкрин-позитивных клеток, в онтогенезе не изменяется в абсолютных вели чинах, но возрастает в процентах от общей толщины пласта клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Горелова М.В. Пролиферативная активность интерфолликулярного эпидермиса кожи височной области мужчин 20–45 лет // Морфология. – 2010. – Т. 137, № 4. – С. 59.

2. Горелова М.В. Направление изменения толщины эпидермиса кожи волоси стой части головы мужчин с учтом пролиферации кератиноцитов // Ученые запис ки Орловского государственного университета. – 2010. – Т. 36, № 2. – C. 150–155.

3. Горелова М.В. Послойное распределение Ki-67- и р53-позитивных клеток в эпидермисе волосистой части головы у мужчин в постнатальном онтогенезе // Уче ные записки Орловского государственного университета. – 2010. – Т. 38, № 4. – C. 180–184.

4. Горелова М.В. Оценка состояния интерфолликулярного эпидермиса в качестве критерия специфической активности ГЛС кожного действия // ХVIII Российский нац.

конгр. "Человек и лекарство": Тез. докл., Москва, 11–15 апр. 2011г. – М., 2011. – С. 591.

5. Горелова М.В. Изучение возрастных особенностей пулов Ki-67- и р53 позитивных кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса человека // ХVIII Россий ский нац. конгр. "Человек и лекарство": Тез. докл., Москва, 11–15 апр. 2011г. – М., 2011. – С. 591.

6. Горелова М.В. Пролиферативная активность эпидермиса височной области у лиц мужского пола с 23 недель эмбрионального до 3 месяцев постэмбрионального развития // Мат. VIII Всероссийской научн. конф. "Бабухинские чтения в Орле", Орл, 1–2 июня 2011.

– Альманах "Ретиноиды". – М.: Изд. ЗАО "Ретиноиды", 2011. – Вып. 32. – C. 247–250.

7. Горелова М.В. Пролиферативная активность интерфолликулярного эпидермиса кожи височной области с 21-й до 40-й недели антенатального периода развития // Морфо логия. – 2011. – Т. 140, № 5. – С. 37.

8. Горелова М.В. Изменение интерфолликулярного эпидермиса кожи височной об ласти у мужчин в онтогенезе // Всероссийская науч. конф. "Регенеративная биология и медицина": Сб. науч. трудов – М., 2011. – С. 51.

9. Горелова М.В., Алексеев А.Г., Жучков С.А. Изучение пролиферативной активно сти кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса кожи височной области мужчин в возрастном аспекте // ХVII Российский нац. конгр. "Человек и лекарство": Тез. докл., Мо сква, 12–16 апр. 2010 г. – М., 2010. – С. 598.

10. Ноздрин В.И., Горелова М.В., Алексеев А.Г., Банин В.В. Морфологические осо бенности эпидермиса и волосяных фолликулов кожи височной области мужчин в возрас тном аспекте // Морфология. – 2010. –Т. 137, № 4. – С. 143.

11. Ноздрин В.И., Горелова М.В., Белоусова Т.А. Возрастные изменения эпидер миса кожи волосистой части головы у мужчин // Морфология. – 2011. –Т. 139, № 1. – С. 74–81.

Соискатель М.В. Горелова БЛАГОДАРНОСТИ Выражаю искреннюю благодарность сотрудникам ЗАО "Ретиноиды" – ведущ. науч. сотр., ст. науч. сотр., доц. Т.А. Белоусовой и зам. директора. по научной работе канд. биол. наук. О.И. Лаврик, докт. мед. наук, проф., чл корр. РАМН, зам. руководителя НИЦ БМТ ГНЦ ВИЛАР Россельхозакадемии В.В. Банину – за обсуждение работы и конструктивные замечания, экспер там и патологоанатомам Бюро судебно-медицинской экспертизы Орловского облздравотдела (рук. – А.М. Лобанов), патологоанатомического отделения Городской больницы им. С.П. Боткина г. Орла (рук. – О.А. Тимошина), экс перту Бюро судебно-медицинской экспертизы №1 г. Москвы Е.В. Колесниковой – за помощь в сборе аутопсийного материала, сотрудни ку кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии МИ ОГУ доц.

С.А. Жучкову и ст. лаб. патологоанатомического отделения Орловской об ластной клинической больницы Л.В. Маркиной – за помощь в освоении гис тологической техники и иммуногистохимических методов.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.