авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Изучение факторов, влияющих на секрецию и биологическую активность химерного белка альбумин- интерферон-альфа16, синтезируемого дрожжами pichia pastoris

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КАРАБЕЛЬСКИЙ

Александр Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ ФАКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА СЕКРЕЦИЮ И

БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ХИМЕРНОГО БЕЛКА "АЛЬБУМИН-

ИНТЕРФЕРОН-АЛЬФА16", СИНТЕЗИРУЕМОГО ДРОЖЖАМИ PICHIA

PASTORIS

03.03.04- клеточная биология, цитология,

гистология 03.01.04- биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2010

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете в лаборатории биохимической генетики кафедры генетики и селекции биолого-почвенного факультета

Научный руководитель: доктор биологических наук Марина Владимировна Падкина

Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Владимир Николаевич Кокряков НИИ экспериментальной медицины РАМН доктор биологических наук Борис Александрович Маргулис Институт цитологии РАН Ведущее учреждение:

ГОУ “Санкт-Петербургский государственный политехнический университет”

Защита состоится " " 2010 г. в часов на заседании совета Д212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан “ “ _ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Л.А.Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Развитие генной инженерии позволило получать белки медицинского назначения в различных системах экспрессии.

Наибольший интерес представляют интерфероны (ИФН) - группа биологически активных белков, синтезируемых клетками в ходе защитной реакции в ответ на вирусное воздействие. Многообразие физиологических функций ИФН указывает на их контрольно-регуляторную роль в сохранении гомеостаза. ИФН обладают противовирусными, антимикробными, противоопухолевыми и иммуномодулирующими свойствами. В геноме человека присутствуют 13 структурных генов ИФН- (INFA). Для некоторых генов (INFA1, INFA2, INFA4) обнаружено явление полиморфизма (Hussain et al., 1997;

Pestka, 2000). Несмотря на высокую степень гомологии ИФН-, спектр активностей может различаться. Например, ИНФ-8 и ИНФ-17 оказались более эффективными в лечении ряда вирусных заболеваний, чем наиболее изученный ИНФ-2b (Garcia et al., 2006;

Escuret et al., 2006). ИФН- интересен тем, что этот белок относится к подтипу ИФН-4, который совместно с ИФН-1 и ИФН-2 составляет основную фракцию интерферонов в индуцированных лейкоцитах (Hiscott et al., 1984). Доклинические испытания рекомбинантного ИФН-16 человека показали, что белок имеет более высокую антивирусную активность по сравнению с Реафероном® (ИФН-2а). Изучение различных представителей семейства интерферонов-альфа позволит установить особенности происхождения генов INFA, причины многообразия свойств ИФН- и определит наиболее эффективные области их практического использования.

В настоящее время существуют лекарственные препараты, созданные на основе Escherichia coli, основой которых являются рекомбинантные интерфероны-альфа: 2а, 2b, 2с. Длительное применение рекомбинантных ИФН бактериального происхождения сопровождается побочными эффектами.

Поэтому улучшение фармакологических свойств рекомбинантных ИФН весьма актуально. Существуют два пути решения этой проблемы.

Использование эукариотических систем экспрессии, в часности, дрожжевых, позволяет осуществлять корректную посттрансляционную модификацию рекомбинантных белков, препараты не содержат бактериальных пирогенов и эндотоксинов, что позволяет снизить спектр побочных эффектов и значительно улучшить качество жизни пациентов в период длительного лечения.

Увеличение периода полужизни рекомбинантного ИФН для снижения частоты инъекций препарата достигается модификацией молекулы белка.

Перспективным подходом является создание химерных молекул, содержащих ИФН-, ковалентно сшитый с полиэтиленгликолем (ПЭГ) или альбумином.

При создании химерных белков следует учитывать, что их свойства могут зависеть от выбранной системы экспрессии, способа создания "гибридного" гена и от условий выделения и очистки.

Очевидно, что оптимальным является использование двух предложенных подходов.

В последнее время для производства рекомбинантных белков различного происхождения используют метилотрофные дрожжи Pichia pastoris, которые обеспечивают высокий уровень продукции и корректную посттрансляционную модификацию гетерологичных белков и позволяют получать секреторные белки, практически аутентичные белкам млекопитающих (Cereghino et al., 2002). Регуляция экспрессии генов, влияние особенностей метаболизма на уровень синтеза гетерологичных белков в дрожжах P. pastoris изучены недостаточно.

Цель и задачи работы. Цель работы состояла в создании штамма метилотрофных дрожжей P. pastoris продуцента химерного белка "Альбумин ИФН-16" и изучении факторов, влияющих на уровень секреции и биологическую активность рекомбинантного белка.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Создание вектора экспрессии, обеспечивающего синтез и секрецию химерного белка "Альбумин-ИФН-16" в дрожжах P. pastoris.

2. Получение штамма дрожжей P. pastoris, секретирующего химерный белок "Альбумин-ИФН-16".

3. Изучение динамики синтеза химерного белка и его влияния на жизнеспособность штамма-продуцента.

4. Анализ влияния условий культивирования дрожжей на уровень секреции рекомбинантного белка и его биологическую активность.

5. Разработка схемы очистки химерного белка из культуральной среды.

Научная новизна исследования. Впервые получен штамм дрожжей P.

pastoris, продуцирующий химерный белок “Альбумин-ИФН-16” (Альбурон16). Показано, что, в отличие от дрожжей Saccharomyces cerevisiae, синтез гибридного белка не оказывает токсичного действия на клетки дрожжей P. pastoris, при этом белок не накапливается в клетке и секретируется в биологически активной форме. Продемонстрировано, что использование 0,5 М неорганического фосфата, снижение температуры и аэрации на стадии индукции синтеза повышает уровень продукции Альбурона16. Установлено, что химерный белок способен агрегировать за счет гидрофобных взаимодействий. Обнаружено, что дрожжи P. pastoris в норме секретируют протеолитические ферменты, которые способны расщеплять гибридный белок.

Предложена гипотеза, объясняющая возможные причины появления протеаз в культуральной жидкости и их роль в метаболизме дрожжевых клеток.

Практическая ценность. Созданный штамм дрожжей P. pastoris продуцент рекомбинантного химерного белка Альбумин-ИФН-16 GS115AbFN16 может быть использован для производства отечественного препарата Альбурона16, обладающего улучшенными фармакологическими свойствами по сравнению с немодифицированными рекомбинантными интерферонами. Условия оптимизации процессов культивирования полученного штамма-продуцента и схемы очистки рекомбинантного белка могут быть положены в основу технологического регламента для такого производства. Полученные в работе данные о влиянии различных факторов на уровень секреции и биологическую активность химерного белка, а также разработанные схемы очистки могут быть использованы для создания штаммов дрожжей P. pastoris продуцентов других сшитых с альбумином белков - ИФН-, интерлейкин-2, и др.

Положения, выносимые на защиту:

1. Присоединение альбумина к ИФН-16 без линкерных аминокислот не снижает биологическую активность интерферона.

2. Дрожжи P. pastoris осуществляют корректный фолдинг химерного белка.

Синтез гетерологичного белка не влияет на жизнедеятельность клеток.

3. Протеазы, в норме секретируемые дрожжами P. pastoris, специфически расщепляют альбумин, что необходимо учитывать при использовании данной системы экспрессии для получения сшитых с альбумином рекомбинантных белков.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на III Московском международном конгрессе “Биотехнология – состояние и перспективы развития" (Москва, 2005), международной школе-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология" (Москва, Пущино, 2006), XI международной школе-конференции "Биология – наука XXI века" (Пущино, 2007), итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за год в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно технологического комплекса России на 2007-2012 годы" (Москва, 2007), международной конференции Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting (Торонто, 2008), V съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров (Москва, 2009), III международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины" (Ростов-на Дону, 2009).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов. Список литературы включает источников (17 публикаций отечественных авторов и 289 публикаций иностранных авторов). Работа изложена на 198 страницах машинописного текста и содержит 50 рисунков и 6 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы. Для амплификации плазмид Bgl II (4) был использован штамм HB101 E. coli Amp AOX MF-alfa (Маниатис и др., 1984). Для получения Ori Xho I (1193) штамма-продуцента химерного белка, Bgl II (1913) состоящего из альбумина (HSA) и Bst1107I (8075) Bgl II (1949) AbFN Bgl II (7890) ИФН-16 человека, использовали pPIC9AbFN BlnI (2492) 10289 bp штамм дрожжей P. pastoris GS 3'-AOX Bsu 36I (2951) (his4) ("Invitrogen", США).

Eco R I (3471) Культивирование полученного штамма BlnI (3497) TT AOX GS115AbFN16 (кроме специальных Bsu 36I (4357) экспериментов) осуществляли в два этапа. На первом этапе на среде BMG Рис. 1. Схема плазмиды pPIC9AbFN.

(пептон, глицерин, дрожжевой экстракт) или BMG2 (глицерин, дрожжевой экстракт) происходил рост клеточной биомассы, а на втором на среде BMM (пептон, метанол, дрожжевой экстракт) или BMM2 (метанол, дрожжевой экстракт) соответственно - индукция синтеза гетерологичного белка.

Плазмиды. При конструировании плазмидного вектора pPIC9AbFN (рис.1) использовали плазмиды pRSAbFN (Парфенова, 2005) и pPIC9 (“Invitrogen”, США).

Вектор pRSAbFN содержит последовательности генов HSA (1800 п.о.) и INFA (500 п.о.) человека.

Методы. Рестрикционный анализ, электрофорез в геле агарозы и полиакриламидном геле (ПААГ), выделение фрагментов ДНК из геля, лигирование, выделение плазмидной ДНК из бактерий и хромосомной ДНК из дрожжей, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), трансформацию бактерий и дрожжей проводили в соответствии со стандартными методиками (Маниатис и др., 1984;

Fujimura a. Sakuma, 1997;

Yamada et al., 1998). Для проведения ПЦР использовали Taq-полимеразу (“Силекс”, г. Москва) и следующие праймеры:

5’-CGGGATCCAAACGATGAAGTGGGTACC-3’ – прямой к гену HSA;

5’-GGAATTCCTCAATCCTTCCTTCTTAATCCT-3’–обратный к гену INFA16.

Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976).

Электрофорез белков в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) проводили по методу Лэммли (Laemli, 1970). Для анализа электрофореграмм использовали компьютерную программу «ImageJ1.32» (URL:

http:rsb.info.nih.gov/ij/). Электроперенос белков с ПААГ на нитроцеллюлозу и гибридизацию с антителами к ИФН-2 и HSA проводили по стандартному методу (Bidwai et al., 1992). Фракцию микросом и белки клеточной оболочки дрожжей P. pastoris выделяли по методу, предложенному Салиола (Saliola et al., 2004). Гель-фильтрацию на Сефакриле S-200 проводили в 20 мМ натрий ацетатном буфере рН 5,5 и 50 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7,0. Гель фильтрацию на BioRad P-300 проводили в 20 мМ натрий-ацетатном буфере рН 5,5;

в отдельных экспериментах буфер дополнительно содержал 0,05% Tween 20 или 0,05% SDS. Гель-фильтрацию на Сефадексе G-25 проводили в 50 мМ буфере трис-HCl pH 7,5;

фосфатном буфере (PBS) рН 6,5 и 50 мМ натрий ацетатном буфере рН 5,5. Хроматографию на голубой сефарозе Cibacron F3GA проводили в 20 мМ натрий-ацетатном буфере рН 5,5;

белки элюировали последовательно 200 мМ KSCN и 500 мМ KSCN в стартовом буфере и 50 мМ трис-HCl pH 8,5. Ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе проводили в 50 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7,0;

элюцию химерного белка осуществляли 0,35 М NaCl в стартовом буфере. Хроматографию на фенил сефарозе CL-4B проводили в 50 мМ натрий-фосфатном буфере pH 7,0 с добавлением сульфата аммония до конечной концентрации 1,5 M, после чего проводили ступенчатую элюцию белков 1,0 М и 0,5 М сульфатом аммония в стартовом буфере, стартовым буфером и 30% изопропиловым спиртом (ИПС).

Раствор с химерным белком после элюции с фенил-сефарозы диализовали против 20 мМ натрий-ацетатного буфера рН 5,5. Биологическую активность Альбурона16 определяли по подавлению цитопатической активности вируса везикулярного стоматита в первичной культуре L-41 кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, чувствительной к ИНФ -типа (Liu et al., 2001). В качестве стандарта использовали человеческий лейкоцитарный интерферон ОСО 42-28 90-87 (ГИСК, Москва).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Создание штамма дрожжей P. pastoris – продуцента химерного белка Альбурона16. Уровень синтеза химерного белка может зависеть от положения генов HSA и IFNA16 в интегративной кассете, наличия или отсутствия линкера между ними, свойств промотора и копийности клонированного гена. При конструировании химерного гена AbFN16 ген HSA соединяли с геном INFA без линкерных нуклеотидов, поскольку присутствие дополнительных аминокислот могло нарушить трехмерную структуру синтезируемого белка и привести к потере биологической активности. В предварительных экспериментах было показано, что дрожжи P. pastoris оказались более эффективными продуцентами HSA, чем ИФН-16. Располагая HSA в N концевой части химерного белка, мы рассчитывали увеличить уровень продукции Альбурона16, обеспечить корректное замыкание дисульфидных связей в молекуле ИФН-16 (Cys1-Cys98) и сохранение биологической активности. Для создания вектора экспрессии pPIC9AbFN (рис.1) химерный ген AbFN16 клонировали в плазмиде pPIC9 под контролем промотора и терминатора гена алкогольоксидазы1 (АОХ1) дрожжей P. pastoris. Сигнальная последовательность фактора MF1 дрожжей S. cerevisiae, которая присутствует в плазмиде, обеспечивает секрецию гетерологичного белка в культуральную среду. Использование сильного индуцибельного промотора гена AOX позволяет регулировать экспрессию гетерологичного гена сменой источника углерода. При трансформации дрожжей штамма GS115 плазмидой pPIC9AbFN происходило замещение экспрессионной кассетой хромосомной копии гена АОХ1 за счет процесса гомологичной рекомбинации (рис. 2).

Полученные трансформанты приобретали фенотип + s His Mut, являлись прототрофами по гистидину и медленно росли на среде с метанолом за счет минорного His+Mut+ изозима Аox2р. Факт интеграции химерного гена AbFN16 в геном His+Muts трансформантов + s His Mut подтверждали методом ПЦР.

Для дальнейшей работы отобрали трансформанты с Рис. 2. Схема интеграции экспрессионной повышенным уровнем синтеза кассеты в локус АОХ1 хромосомной ДНК P.

гетерологичного белка, что pastoris.

могло быть обусловлено спонтанной интеграцией нескольких копий клонированного гена (Romanos et al., 1991b).

После выращивания трансформантов анализировали культуральную среду методом электрофореза в ПААГ в присутствии SDS. В качестве контрольных штаммов в идентичных условиях выращивали исходный штамм GS115, штамм продуцент HSA человека - GS115HSA и штамм-продуцент ИФН-16 GS11516. Трансформанты GS115AbFN16 синтезировали белок, который давал положительную реакцию с моноклональными антителами к ИФН-2 и HSA, и имел молекулярную массу 86 кДа, что соответствует ожидаемой молекулярной массе Альбурона16 (рис. 3а-в).

Изучение динамики синтеза и секреции химерного белка. Достоинством системы экспрессии P. pastoris является возможность получения секреторных продуцентов рекомбинантных белков человека, поскольку секретируемые белки не оказываются гипергликозилированными, а по строению углеводных компонентов схожи с гликопротеинами высших эукариот. Сигналом транслокации химерного белка в эндоплазматический ретикулум (ЭПР), транспорта в аппарат Гольджи (АГ), к плазматической мембране и его секреции в культуральную среду является MF1 дрожжей S. cerevisiae. Известно, что синтез гетерологичных белков в дрожжах S. cerevisiae может негативно влиять на метаболизм штамма-продуцента (Парфенова и др., 2002). Данные о влиянии продукции гетерологичных белков на дрожжи P. pastoris отсутствуют. В случае секреторных продуцентов неправильно свернутые рекомбинантные белки могут агрегировать и накапливаться в ЭПР, что вызовет развитие ответа на несвернутые белки (UPR) и клеточную гибель. Для того чтобы выяснить, не происходит ли задержка химерного белка в процессе секреции, изучили динамику появления Альбурона16 в микросомальной фракции, белках клеточной оболочки и культуральной среде штамма-продуцента (рис. 4).

Мы выяснили, что химерный белок появляется в микросомальной фракции через 24 часа после начала индукции синтеза, в следовых количествах присутствует в ней через 48 часов. Следовательно, Альбурон16 не накапливается в ЭПР. В культуральной жидкости количество рекомбинантного белка возрастало в течение 48 часов индукции синтеза. Среди белков клеточной оболочки рекомбинантный белок не был обнаружен. Секретируемый химерный белок Альбурон обладал биологической активностью и взаимодействовал с моноклональными антителами к HSA и ИФН-2. Полученные результаты говорят о том, что в ходе своего синтеза и секреции в дрожжах P. pastoris Альбурон16 принимает пространственную структуру, обеспечивающую выполнение его биологических функций. Негативное влияние гетерологичного белка на жизнеспособность продуцентов S. cerevisiae и E. coli может приводить к потере рекомбинантных плазмид и раннему выходу клеток на стационарную фазу роста (Remaut et al., 1986;

Парфенова и др., 2002).

Мы показали, что штамм GS115AbFN16 дрожжей P. pastoris сохранял фенотип His+Muts в течение длительного времени при многократных пересевах, экспрессия чужеродного гена не влияла на параметры роста клеточной культуры.

Таким образом, синтез гетерологичного химерного белка не оказывает токсичного действия на метаболизм дрожжей P. pastoris.

Изучение влияния условий культивирования штамма GS115AbFN16 на уровень секреции Альбурона16. Условия культивирования штаммов продуцентов - интенсивность аэрации, время и температура, концентрация основных компонентов среды могут влиять на выход белка. Мы показали, что максимальный выход биомассы наблюдается при отношении Vкульт. жидкости / Vвоздушной среды равном 1:4, что подтверждает важную роль процессов дыхания в метаболизме метилотрофных дрожжей. В то же время, оказалось, что на стадии индукции синтеза рекомбинантного белка оптимальным является отношение 1:1 (рис. 5a).

кДа 116 66 45 35 25 18 116 66 45 35 25 18 2 3 а) 5 5 в) б) Рис. 5. Денситограмма белков культуральной среды после культивирования штамма GS115AbFN16 в различных условиях. Черным цветом отмечены пики, соответствующие Альбурону16, серым - продукты его протеолиза. 1 – маркеры молекулярной массы.

а) Зависимость уровня продукции гетерологичного белка от отношения Vкультуральной жидкости / Vвоздушной среды на стадии индукции синтеза: 2) – культуральная среда штамма GS115AbFN16 без добавления метанола;

3) – 1:4;

4) – 2:3;

5) – 1:1.

б) Влияние концентрации фосфата в культуральной среде на уровень продукции химерного белка: 2) – культуральная среда BMG без добавления метанола (контроль);

3) – 0,1 М натрий-цитратный буфер рH 6,0;

4) – 0,05 M калий фосфатный буфер рH 6,0;

5) – 0,1 M калий-фосфатный буфер рН 6,0.

в) Влияние времени и температуры на выход химерного белка и его протеолиз: 2) – исходный штамм GS115;

3) – 48 часов при 300С;

4) – 48 часов при 250С;

5) – 48 часов при 200С;

6) – 96 часов при 300С;

7) – 96 часов при 250С;

8) – 96 часов при 200С.

Известно, что неорганический фосфат (Pi) участвует в регуляции различных процессов в клетках дрожжей S. cerevisiae (Oshima, 1997). Данные о регуляции фосфатом метаболизма P. pastoris фрагментарны. Мы показали, что Pi в концентрации 0,007 М, необходимой для роста клеток, не обеспечивает продукцию рекомбинантного белка. В то же время увеличение концентрации фосфата от 0,05 до 0,1 М снижает уровень секреции химерного белка (рис. 5б).

Полученные результаты говорят о том, что Pi может принимать участие в регуляции различных этапов синтеза и секреции белков в дрожжах P. pastoris.

Выход рекомбинантного белка зависит от времени культивирования и стабильности гетерологичного продукта. При изучении динамики синтеза Альбурона16 выяснили, что продукция белка увеличивается в течение 48 часов после начала индукции метанолом (рис. 4, 5в).

Более продолжительное культивирование не приводило к увеличению количества белка в культуральной среде, что могло быть обусловлено частичным лизисом клеток и последующей деградацией рекомбинантного белка внутриклеточными протеолитическими ферментами. Мы показали, что 25-30оС проведение индукции синтеза Альбурона16 при температуре сопровождалось появлением в культуральной жидкости белков с молекулярной массой около 25 кДа, 40-45 кДа и 60 кДа (рис. 5в), которые отсутствовали в культуральной среде исходного штамма. Эти результаты позволили предположить, что данные белки могут быть продуктами протеолиза Альбурона16. Снижение температуры до 200С на стадии индукции синтеза гетерологичного белка увеличивало количество секретируемого белка на ~20 25%, в культуральной среде штамма-продуцента отсутствовали белки с меньшей молекулярной массой (рис. 5в). Возможно, понижение температуры активности протеаз (Dragosits et al., 2008).

приводит к снижению о Культивирование при 20 С позволило проводить индукцию синтеза рекомбинантного белка в течение 96 часов без снижения количества химерного белка.

Изучение стабильности рекомбинантного химерного белка.

Протеолитическая деградация секретируемых рекомбинантных белков является существенной проблемой. Известно, что в дрожжах S. cerevisiae в процессе секреции белки могут подвергаться протеолитическому расщеплению, по крайней мере, двумя протеазами – Kex2p и Yps1p (Azaryan et al., 1993;

Cawley et al., 1995;

Lengerwood et al., 1995;

Krysan et al., 2005). Ортологи этих ферментов обнаружены и в дрожжах P. pastoris, однако их свойства до конца не изучены (Werten a. Wolf, 2005). Мы показали, что протеолитическое расщепление Альбурона16 происходит в культуральной жидкости и после удаления клеток. Это говорит о том, что дрожжи P. pastoris секретируют протеолитические ферменты в культуральную жидкость. При этом секреция протеаз не являлась ответом клетки на синтез рекомбинантного белка, так как протеазы секретировали не только штаммы-продуценты, но и исходные штаммы дрожжей. Учитывая тот факт, что рекомбинантный ИФН-16 не расщепляется протеазами в культуральной жидкости (Падкина и др., 2002), можно предположить, что деградации подвергается только альбуминовая часть химерного белка. Мы изучили влияние рН, хелатирующих агентов (ЭГТА, ЭДТА) и ингибитора сериновых протеаз (PMSF) на протеолиз Альбурона16.

Протеолитическая деградация химерного белка происходила в широком диапазоне рН (5,5 – 7,5) даже при +4оС. Фрагменты, образующиеся в ходе протеолиза Альбурона16 при рН 5,5 и рН 7,5, различались по молекулярным массам (рис. 6). При рН 7,5 на электрофореграмме присутствовали фрагменты преимущественно с молекулярной массой ~60 кДа, а при рН 5,5 фрагменты с молекулярной массой ~60 кДа, ~ 40-45 кДа, и ~33 кДа. В пробах с рН 6, спектр белков выглядел как промежуточный вариант между спектрами в пробах с кислым и более щелочным значениями рН. При рН 5,5 Альбурон16 не расщеплялся в пробах с ЭГТА, в то время как при рН 7,5 незначительное снижение уровня протеолиза происходило лишь в пробах с PMSF или ЭДТА.

При этом фрагменты белка с молекулярной массой ~40-45 кДа обладали биологической активностью, что можно объяснить присутствием в них молекулы ИФН-16. Полученные результаты позволили предположить, что в протеолизе рекомбинантного белка Альбурона участвуют как минимум 2 фермента. Один из них работает в нейтральной или щелочной области рН, является металл-зависимым ферментом и, вероятно, относится к группе сериновых протеаз. Возможно, этим ферментом в дрожжах P. pastoris является ортолог протеазы Kex2p дрожжей S. cerevisiae. Kex2p локализован в АГ и его появление в культуральной жидкости можно объяснить частичным лизисом клеток дрожжей в процессе длительного культивирования. Другой фермент является 2+ Са -зависимым, работает в кислой области рН.

Такими характеристиками обладает, в частности, ортолог аспарагиновой протеазы Yps1p (япсин) дрожжей S. cerevisiae.

Япсины S. cerevisiae – это GPI-связанные белки, которые могут быть локализованы в мембране или клеточной стенке в зависимости от аминокислотной последовательности в -сайтах.

Япсины синтезируются в виде предшественников, которые в результате автокатализа превращаются в зрелый фермент (Azaryan et al., 1993). Процессинг и активность япсинов зависят от рН. Данные о локализации япсинов и регуляции их активности у P. pastoris недостаточны. Анализ последовательностей аминокислот Yps1p S. cerevisiae и Yps1p P.

pastoris (UniProtKB) выявил отличия в -сайте, которые могут приводить к секреции япсина P.

pastoris в культуральную жидкость. Мы показали, что молекулярная масса продуктов протеолиза Альбурона16 зависит от рН.

Вероятно, изменение рН влияет не только на эффективность работы фермента, но и определяет его специфичность. Возможно, способность дрожжей P.

pastoris к быстрому росту и накоплению большой биомассы обусловлена секрецией япсинов, которые обеспечивают эффективную утилизацию различных субстратов.

Таким образом, протеолиз секретируемого дрожжами P. pastoris химерного белка Альбурона16, вероятно, может осуществлять также ортолог протеазы Yps1p дрожжей S. cerevisiae. Снижение температуры культивирования, использование буферных растворов с нейтральным или щелочным значением рН, добавление ЭГТА до конечной концентрации 5мМ позволяют уменьшить активность протеазы и, тем самым, повысить выход рекомбинантного белка и обеспечить сохранение биологической активности.

Выделение и очистка химерного белка Альбурона16. Использование секреторных продуцентов существенно упрощает очистку рекомбинантных белков. Выращивание дрожжей в условиях дефицита азота сопровождается усилением синтеза протеаз и, как следствие, уменьшением количества секретируемого гетерологичного продукта (Kobayashi et al., 2000). Одним из способов снижения уровня протеолиза секреторных белков является использование культуральных сред с пептоном. Поэтому мы разработали схему очистки Альбурона16 из среды BMM, включающую стадии ультрафильтрации для концентрирования и удаления низкомолекулярных белков, осаждения 75% сульфатом аммония, гель-фильтрации на Cефакриле S-200, хроматографии на голубой сефарозе Cibacron F3GA для удаления примесных белков и гель-фильтрации на Сефадексе G-25 для смены буферного раствора. Несмотря на 90% очистку целевого белка от примесей и 75% выход, удельная биологическая активность Альбурона16 уменьшалась (табл. 1).

Табл. 1.

Очистка Альбурона16 из культуральной среды BMM.

Объем, Суммарный Биологическая Удельная биологическая Стадии очистки мл белок, мг активность, МЕ\мл активность, МЕ/мг Культуральная среда BMМ 1000 90,0 2000 Ультрафильтрация и осаждение 75% сульфатом 20 33,0 317000 аммония Гель-фильтрация на 80 9,8 15000 Сефакриле S- Хроматография на Cibacron 10 3,5 7000 F3GA Известно, что рекомбинантные ИФН- и сшитые с альбумином белки образуют агрегаты, в основном, за счет гидрофобных взаимодействий (Ruiz et al., 2003;

Chou et al., 2005;

Hawe a. Friess, 2007). Мы предположили, что агрегация может быть основной причиной снижения биологической активности химерного белка Альбурона16. Для проверки этого предположения провели фракционирование Альбурона16 на биогеле BioRad P-300 в присутствии различных детергентов. Фракционирование в присутствии ионного детергента (SDS) приводило к уменьшению первого пика, соответствующего агрегированным молекулам белка, что свидетельствует о разобщении белковых агрегатов. Добавление неионного детергента (Tween-20) 2 в стартовый буфер способствовало еще большей агрегации белка, о чем свидетельствует уменьшение объема элюции Альбурона16 (рис.

7).

Разное поведение химерного белка, возможно, обусловлено свойствами использованных Рис. 7. Профиль элюции Альбурона16 при детергентов. В присутствии SDS гель-фильтрации на BioRad P-300 с возрастала и биологическая добавлением и без добавления детергентов.

активность химерного белка. При 1 – 20 мМ натрий-ацетатный буфер рН 5,5;

этом активность была 2 – Tween20 0,05%;

3 – SDS 0,05%.

максимальной при pH 5,5 (табл.

2), что согласуется с данными о влиянии состава буфера на стабильность и биологическую активность рекомбинантного ИФН-16 (Падкина и др., 2007).

Полученные результаты подтвердили предположение о том, что агрегация химерного белка, обусловленная гидрофобными взаимодействиями, приводит к снижению биологической активности.

Табл. 2.

Зависимость биологической активности химерного белка от pH и состава буфера.

Биологическая активность, ME/мл Буферные растворы Без SDS 0,05% SDS 50 мМ трис-HCl pH 7,5 8000 Фосфатный буфер (PBS) pH 6,5 29000 50 мМ натрий-ацетат pH 5,5 320000 Очистка Альбурона16 из среды BMM2. Осаждение Альбурона16 сульфатом аммония может усиливать гидрофобные взаимодействия, поэтому в дальнейшем осаждали химерный белок полиэтиленгликолем (ПЭГ). После осаждения ПЭГ Альбурон16 не агрегировал, а его биологическая активность оказалась в два раза выше, чем после осаждения сульфатом аммония. Кроме того, индукцию синтеза рекомбинантного белка проводили на среде BMM2, которая в отличие от BMM, не содержит пептона. Необходимость подобной модификации среды продиктована тем, что использование пептона животного происхождения при культивировании дрожжей-продуцентов белков медицинского назначения нежелательно.

Новая схема очистки Альбурона включала следующие стадии:

для ультрафильтрацию концентрирования среды и удаления примесных белков с молекулярной массой меньше 50кДа;

обработку культуральной среды тетраборатом натрия для удаления полисахаридов;

на ионообменную хроматографию ДЭАЭ-целлюлозе для удаления основных примесных белков;

осаждение рекомбинантного белка 25% ПЭГ 3350;

гель-фильтрацию на Сефакриле S- для удаления остатков ПЭГ и белков с меньшей молекулярной массой;

хроматографию на фенил-сефарозе для удаления остаточных количеств примесных белков и продуктов протеолиза (рис. 8).

Использование данной схемы позволило получить на 85% очищенный препарат Альбурона16 с конечным выходом 80% без потери биологической активности (табл. 3). Удельная активность очищенного препарата гибридного белка Альбурона16 составляла 0,4-1,0106 МЕ/мг. Учитывая, что молекулярная масса альфа16–интерферона человека 20 кДа, а молекулярная масса альбумина – кДа, доля активного компонента: альфа16–интерферона человека, в молекуле гибридного белка составляет примерно 23%. Исходя из этого, можно заключить, что присоединение альбумина не приводит к существенному снижению биологической активности альфа16–интерферона человека, которая составляет 0,3 - 1,1107 МЕ/мг (Падкина и др., 2009).

Табл. 3.

Очистка Альбурона16 из культуральной среды BMM2.

Биологическая Удельная Суммарный Альбурон16, Стадии очистки активность, биологическая Объем, мл белок, мг мг МЕ\мл активность, МЕ/мг Культуральная среда 1000 40,0 3,2 640 BMM Ультрафильтрация и 20 9,0 3,0 52000 хроматография на ДЭАЭ целлюлозе Осаждение ПЭГ и Гель 30 6,6 2,7 35000 фильтрация на Сефакриле S- Хроматография на фенил 4 3,0 2,6 286000 сефарозе Разработанная нами схема очистки Альбурона16 из культуральной среды BMM2 дрожжей P. pastoris, может быть легко масштабирована и усовершенствована с помощью технологии STREAMLINE™, что может способствовать внедрению в производство технологии получения нового лекарственного препарата на основе рекомбинантного химерного белка Альбурона16.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, нами впервые получен штамм дрожжей P. pastoris продуцент гибридного рекомбинантного белка Альбурона16, состоящего из альбумина человека и лейкоцитарного интерферона-16, защищенный патентом Российской Федерации (Падкина и др., 2009). Мы показали, что присоединение альбумина не влияет на биологическую активность ИФН-16. Использованный способ конструирования вектора, а именно: отсутствие линкера между геном HSA и INFA16 и расположение гена HSA со стороны 5’-конца экспрессионной кассеты, способствовало правильному замыканию -S-S- связей в молекуле ИФН-16 и сохранению конформации белка, что обеспечило выполнение им биологических функций. Изучение динамики секреции химерного белка показало, что Альбурон16 не накапливается в ЭПР и не задерживается на поверхности клетки, а его секреция происходит в течение 48 часов после начала индукции. При этом синтез чужеродного белка не влияет на параметры роста клеточной культуры, а полученный штамм-продуцент стабилен в течение длительного времени. Оптимизация условий культивирования позволила увеличить конечный выход целевого продукта на ~30%. Мы обнаружили в культуральной среде дрожжей P. pastoris как минимум две протеазы, присутствие которых не является ответом клетки на синтез гетерологичного белка. Одна из протеаз, по-видимому, относится к группе япсинов и секретируется в среду, а другая, возможно, является ортологом Kex2p S.

cerevisiae. Появление Kex2p в культуральной жидкости можно объяснить частичным лизисом клеток в ходе культивирования. Изучение свойств экстраклеточных протеаз позволило снизить уровень протеолиза рекомбинантного белка за счет повышения значения рН и добавления хелатирующих соединений, связывающих ионы Са2+. Мы обнаружили, что химерный белок может агрегировать и при этом терять биологическую активность. Были предложены условия выделения и хранения белка, при которых не происходит его агрегации и сохраняется биологическая активность.

Результаты наших исследований могут быть использованы для создания на основе метилотрофных дрожжей P. pastoris продуцентов новых химерных молекул (например, ИФН-Альбумин-ИФН, ИФН-АТ и др.), для оптимизации условий культивирования штаммов дрожжей продуцентов различных рекомбинантных белков и для усовершенствования способов очистки этих белков.

ВЫВОДЫ Полученный впервые штамм GS115AbFN16 дрожжей Pichia pastoris 1.

обеспечивает синтез химерного белка Альбурона16, состоящего из альбумина и ИФН-16 человека. Присоединение альбумина не влияет на биологическую активность ИФН-16.

2. Изучение динамики секреции химерного белка показало, что рекомбинантный белок не оказывает негативного влияния на клетки дрожжей, не накапливается в ЭПР и не остается на поверхности клетки.

3. Продукция химерного белка зависит от концентрации неорганического фосфата и увеличивается при снижении степени аэрации и температуры культивирования до 20оС на стадии индукции синтеза.

В культуральной жидкости дрожжей P. pastoris присутствуют протеазы, 4.

секреция которых не является ответом клетки на синтез чужеродного белка.

Рекомбинантный химерный белок, секретируемый дрожжами P. pastoris, 5.

подвергается протеолитической деградации, степень которой зависит от присутствия ионов кальция и значения рН. Совокупность данных о свойствах протеаз дрожжей и размерах фрагментов позволили предположить, что в расщеплении Альбурона16, возможно, участвует аспарагиновая протеаза Yps1p дрожжей P. pastoris.

6. Обнаружена способность химерного белка к агрегации за счет гидрофобных взаимодействий, что приводит к значительному снижению его биологической активности.

7. Разработаны схемы очистки Альбурона16 из культуральных сред, позволяющие предотвратить его агрегацию и получать на 85% очищенный рекомбинантный белок с сохранением биологической активности.

CПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Карабельский А.В., Падкина М.В. Рекомбинантные интерфероны-альфа человека пролонгированного действия // Вестник СПбГУ. 2007. сер. 3. вып.

4. С. 45-53.

2. Карабельский А.В., Зиновьева Ю.Г., Смирнов М.Н., Падкина М.В.

Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris продуцентов химерных белков “альбумин-интерлейкин-2” и “альбумин-интерферон-16” // Вестник СПбГУ. 2009. сер. 3. вып. 2. С. 52-62.

3. Падкина М.В., Карабельский А.В., Зиновьева Ю.Г., Самбук Е.В., Смирнов М.Н. Способ получения рекомбинантных белков, модифицированных присоединением альбумина человека, из культуральной жидкости дрожжей // Патент РФ RU 2373286 C2. 2009.

4. Падкина М.В., Доброгорская М.В., Карабельский А.В., Самбук Е.В., Смирнов М.Н. Способ получения фармацевтического препарата из культуральной среды дрожжей и фармацевтический препарат на основе альфа интерферона человека (варианты) // Заявка № 2007143928. Дата приоритета 29.11.07. Решение о выдаче патента РФ 26.09.09.

5. Карабельский А.В., Парфенова Л.В., Смирнов М.Н., Падкина М.В.

Создание штамма дрожжей Pichia pastoris продуцента гибридного белка “Альбуферона16”. III Московский международный конгресс “Биотехнология – состояние и перспективы развития”. 2005. С. 74-75.

6. Карабельский А.В., Падкина М.В. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris продуцента гибридного белка “Альбурона16”. Международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология». 2006.

С. 206-208.

7. Карабельский А.В., Зиновьева Ю.Г., Падкина М.В. Изучение протеолитического расщепления химерных рекомбинантных белков, секретируемых метилотрофными дрожжами Pichia pastoris. международная школа-конференция "Биология – наука XXI века". 2007. С.

205.

8. Падкина М.В., Самбук Е.В., Смирнов М.Н., Градобоева А.Е., Доброгорская М.В., Карабельский А.В., и др. Получение и совершенствование штаммов дрожжей Pichia pastoris продуцентов высокоселективных лекарственных препаратов на основе альфа16-интерферона человека и химерного белка, состоящего из целевого белка и альбумина плазмы крови человека.

Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы". 2007, С.

105-107.

9. Alexander V. Karabelsky, Marina V. Padkina. The development of Pichia pastoris strain producing recombinant fusion protein “human serum albumin IFN16” and optimization of yeast cultivation process. Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting. 2008. P. 266.

10. Карабельский А.В., Падкина М.В. Оптимизация условий культивирования штаммов дрожжей Pichia pastoris продуцентов рекомбинантных белков. V съезд Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров. 2009. ч. 1. С.

545.

11. Карабельский А.В., Падкина М.В. Альбурон16: противовирусный лекарственный препарат нового поколения, синтезируемый в дрожжах. III международная научно-практическая конференция "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины". 2009. С. 184-185.

Подписано в печать «25» января 2010 года. Формат 60x84 1/16.

Усл. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 236.

Отпечатано в Цифровом Копировальном Центре «Средний, 28»

199004, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., 28. Тел.: (812) 323-40-

 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.