авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Метаболизм аргинина и его метилированных аналогов в физиологических условиях и при остром повреждении почек у крыс

На правах рукописи

СУХОВЕРШИН

Роман Александрович

МЕТАБОЛИЗМ АРГИНИНА И ЕГО МЕТИЛИРОВАННЫХ

АНАЛОГОВ В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ И ПРИ

ОСТРОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПОЧЕК У КРЫС

03.03.01 – физиология

03.01.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Новосибирск – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт физиологии» Си бирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель доктор биологических наук ГИЛИНСКИЙ Михаил Абрамович

Официальные оппоненты:

ИВАНОВА Людмила Николаевна академик РАН, доктор меди цинских наук, профессор, ФГБУН «Институт цитологии и генети ки» СО РАН, советник РАН ВАВИЛИН Валентин Андреевич доктор медицинских наук, про фессор, ФГБУ «НИИ молекулярной биологии и биофизики» СО РАМН, руководитель лаборатории метаболизма лекарств и фарма кокинетики

Ведущая организация Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здраво охранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится 30 мая 2012 г. в 1000 часов на заседании диссер тационного совета Д 001.014.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фи зиологии» Сибирского отделения Российской академии медицин ских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4;

тел.: 8-383-334 89-61).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно исследовательский институт физиологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4).

Автореферат разослан 27 апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Бузуева Ирина Ивановна Общая характеристика диссертации Актуальность темы Оксид азота (NO) выполняет в организме многие жизненно важные функции. Анализу этих функций посвящено несколько об зоров [Lowenstein and Snyder, 1992;

Марков, 2001]. Нарушение про дукции NO вовлечено в развитие ряда заболеваний, включая эндо телиальную и эректильную дисфункции, гипертензию и атероскле роз [Родионов и др., 2008].

Аминокислота аргинин (АРГ) и её метилированные аналоги (метиларгинины) играют ведущую роль в регуляции биодоступно сти NO в организме [Гилинский, 2007]. АРГ служит субстратом внутриклеточного фермента NO-синтазы (NOS), производящего эн догенный NO [Sessa, 1994]. Монометиларгинин (ММА) и асиммет ричный диметиларгинин (АДМА) являются конкурентными инги биторами всех изоформ NOS. Они блокируют АРГ-связывающий участок фермента, препятствуя образованию фермент-субстратного комплекса [Rees et al., 1990;

Vallance et al., 1992]. Даже небольшое повышение концентрации АДМА вне клетки соответствует такому изменению внутриклеточного уровня АДМА, которое достаточно для подавления активности NOS [Cardounel et al., 2007]. Структур ный изомер АДМА – симметричный диметиларгинин (СДМА), не влияет на активность NOS, но конкурирует с АРГ за трансмембран ные переносчики в клетку, ограничивая доступность АРГ для NOS [Closs et al., 1997].

В этой связи изучение метаболизма АРГ и метиларгининов, а также особенностей регуляции продукции NO эндогенными мети ларгининами в физиологических условиях и при различной патоло гии in vivo в последнее время привлекает внимание всё большего количества исследователей [Bger, 2009].

Известно, что АРГ синтезируется в организме, а также высво бождается из клеточных белков и поступает с пищей [Morris, 2006].

Метиларгинины образуются при посттрансляционной модификации АРГ-содержащих белков и высвобождаются в результате протеоли за [Anthony et al., 2005]. Только свободные АДМА и ММА способны ингибировать NOS.

Элиминация свободных ММА и АДМА осуществляется пре имущественно путём ферментативного гидролиза диметиларгинин диметиламиногидролазой (ДДАГ) [Ogawa et al., 1987]. Лишь не большая доля данных веществ выводится с мочой в неизменном ви де [Achan et al., 2003]. Напротив, СДМА не подвергается фермента тивной деградации и элиминируется путём экскреции с мочой [Yudkoff et al., 1984].

Важным органом для метаболизма АРГ и его метилированных аналогов являются почки. Они не только обеспечивают экскрецию данных веществ с мочой, но участвуют в реализации и других меха низмов, связанных с поддержанием определённого уровня циркули рующих в крови АРГ и метиларгининов. Клетки проксимальных ка нальцев почки являются основным местом продукции АРГ в орга низме млекопитающих [Dhanakoti et al., 1990] и этот метаболиче ский путь служит важным источником циркулирующего в крови АРГ [Featherson et al., 1973]. Кроме того, в ткани почки содержится большое количество ДДАГ, обеспечивающее ферментативную эли минацию АДМА и ММА [Tojo et al, 1997;

Leiper et al., 1999].

В крови пациентов с хронической болезнью почек (ХБП) заре гистрированы повышенные уровни АДМА и СДМА [Schwedhelm and Bger, 2011]. Увеличение циркулирующего в крови АДМА со провождалось подавлением синтеза NO, и ассоциировалось с разви тием сердечно-сосудистой патологии (эндотелиальная дисфункция, атеросклероз, гипертензия и пр.) [Siroen et al., 2006]. Из представ ленных в литературе данных видно, что роль почек в метаболизме метиларгининов комплексная и изучена недостаточно. Большинство исследований в отношении метаболизма АРГ и его метилированных аналогов при нарушении функции почек являются клиническими и сфокусированы на ХБП. В то же время в литературе отсутствуют работы, направленные на изучение влияния острого повреждения почек на уровни циркулирующих в крови метиларгининов и их экс крецию с мочой. Однако такие исследования, вероятно, могли бы способствовать более полному пониманию роли почек в регуляции уровней метиларгининов. Кроме того, эти исследования помогли бы выяснить, имеют ли метиларгинины какую-либо патогенетическую значимость при синдроме острой почечной недостаточности (ОПН).

Цель работы Определить влияние острого повреждения почек на почечную экскрецию и метаболизм аргинина и его метилированных аналогов, а также выяснить роль данных веществ в нарушении продукции ок сида азота при остром повреждении почек на модели глицериновой острой почечной недостаточности.

Задачи исследования 1. Исследовать суточную экскрецию аргинина, монометиларги нина, асимметричного и симметричного диметиларгининов с мочой в физиологических условиях и при остром повреждении почек.

2. Определить концентрации аргинина, монометиларгинина, асимметричного и симметричного диметиларгининов, а также их соотношения в плазме крови и почечной ткани в физиологических условиях и при остром повреждении почек.

3. Оценить активность диметиларгинин диметиламиногидролазы в почечной ткани в физиологических условиях и при остром повре ждении почек.

4. Измерить скорость продукции аргинина в почечной ткани в физиологических условиях и при остром повреждении почек.

5. Определить концентрацию в крови и суточную экскрецию с мочой конечных стабильных метаболитов оксида азота (нит рит/нитрат-ионов) в физиологических условиях и при остром по вреждении почек.

Научная новизна Впервые показано, что почечная экскреция аргинина, мономе тиларгинина и симметричного диметиларгинина не изменяется при остром повреждении почек, индуцированном глицерином у крыс, а экскреция асимметричного диметиларгинина многократно увеличи вается.

Обнаружено, что при острой почечной недостаточности у крыс концентрация циркулирующего в крови асимметричного димети ларгинина значимо не меняется, несмотря на значительный рост экскреции этой аминокислоты с мочой. Напротив, на фоне сохран ной почечной экскреции аргинина, монометиларгинина и симмет ричного диметиларгинина, уровень аргинина в системном кровотоке снижается, а симметричного диметиларгинина значительно увели чивается.

Выявлено, что содержание аргинина и его метилированных аналогов в почечной ткани при остром повреждении почек, индуци рованном глицерином, уменьшается вдвое.

Впервые продемонстрировано, что при остром повреждении почек в организме возрастает продукция симметричного диметилар гинина, несмотря на то, что общий метаболизм монометиларгинина (предшественника симметричного диметиларгинина) не изменяется.

Установлено, что активность диметиларгинин диметиламино гидролазы и скорость продукции аргинина в почечной ткани уменьшаются под влиянием острой почечной недостаточности. По давление активности диметиларгинин диметиламиногидролазы в ткани почки не приводит к повышению концентрации асимметрич ного диметиларгинина в плазме за счёт увеличения его экскреции с мочой.

Впервые выявлено, что при остром повреждении почек, как в крови, так и в почечной ткани уменьшается отношение АРГ/(ММА+АДМА). Изменение баланса субстрата и эндогенных ингибиторов NO-синтазы приводит к снижению биодоступности оксида азота (количество эндогенного оксида азота, доступного для клеток-мишеней) в организме.

Научно-практическая значимость Данная работа носит преимущественно фундаментальный ха рактер и существенно расширяет представления о механизмах регу ляции уровня циркулирующих в крови аргинина и его метилирован ных аналогов. Полученные данные также демонстрируют вклад из менений метаболизма аргинина и метиларгининов в снижение син теза оксида азота и являются шагом к разработке способов коррек ции нарушений биодоступности оксида азота при патологии почек.

Полученные результаты работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов.

Положения, выносимые на защиту 1. Острое повреждение почек у крыс не оказывает влияния на по чечную экскрецию аргинина, монометиларгинина, симметричного диметиларгинина и увеличивает экскрецию асимметричного диме тиларгинина. При этом продукция симметричного диметиларгинина в организме увеличивается, а метаболизм монометиларгинина не изменяется.

2. Ферментативный путь элиминации асимметричного димети ларгинина в почечной ткани при остром повреждении почек подав ляется, однако это нарушение не приводит к повышению концен трации асимметричного диметиларгинина в плазме крови за счёт компенсаторного увеличения его почечной экскреции.

3. Продукция аргинина почечной тканью при остром поврежде нии почек подавляется, а его концентрация в крови и ткани почки снижается, что приводит к уменьшению количества субстрата NO синтазы (аргинина) на единицу её эндогенных ингибиторов (моно метиларгинина и асимметричного диметиларгинина) и, как след ствие, к снижению биодоступности оксида азота в почке и в целом организме.

Апробация работы Материалы, изложенные в диссертации, представлены на XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (г. Калуга, 19 25 сентября 2010 г.), на XLVII ERA-EDTA Congress (г. Мюнхен, Германия, 25-28 июня 2010 г.), 5th International Symposium on ADMA (г. Чикаго, США, 11-12 ноября 2010 г.), на I всероссийской научной конференции молодых учёных «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (г. Санкт-Петербург, 21-22 декабря 2010 г.), на конкурсе молодых учёных ФГБУ «НИИ физиологии» СО РАМН на лучшую научно-исследовательскую работу (г. Новосибирск, марта 2012 г.).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ (из них – 5 статей в центральной печати).

Объем и структура диссертации Материал диссертации изложен на 119 страницах машинопис ного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, мате риалы и методы исследования, результаты исследования, обсужде ние результатов, заключение, выводы, список литературы. Диссер тация содержит 13 таблиц и 24 рисунка. Список цитируемой литера туры включает 182 источника, в том числе 8 отечественных и зарубежных авторов.

Материалы и методы исследования Эксперименты проведены на половозрелых самцах крыс Wistar массой 180 – 220 г. Животные содержались индивидуально в мета болических клетках (Tecniplast, Italy) при 12-часовом цикле освеще ния со свободным доступом к воде и пище. Экспериментальный протокол одобрен этическим комитетом ФГБУ «НИИ физиологии»

СО РАМН и выполнен в соответствии с директивами 86/609/EC.

Острое повреждение почек (n=33) инициировали инъекцией 50% водного раствора глицерина в мышцы обеих задних конечно стей (всего 10 мл/кг веса) [Zager, 1996]. За 24 ч до инъекции живот ных лишали доступа к воде. Сразу после введения глицерина доступ к воде восстанавливали. Животным контрольной группы (n=31) вводили 0.9% раствор NaCl в том же объёме. Спустя 72 ч после инъ екции регистрировали суточный объём мочи и забирали образец мо чи для анализа. Затем животных декапитировали для забора крови и ткани почки.

Концентрации креатинина и мочевины в плазме и суточной моче определяли стандартными диагностическими наборами (Flu itest, Biocon, Germany). Почечный клиренс вещества (XCL) рассчиты вали по формуле XCL=UX*V/PX/1440, где XCL – клиренс вещества X (мл/мин), UX – концентрация X в моче, PX – концентрация X в плаз ме крови, V – объём мочи (мл). Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) принимали равной клиренсу креатинина. Экскретируемую фракцию вещества (EFX) рассчитывали по формуле EFX=XCL*100/СКФ, где EFX – экскретируемая фракция (%), XCL – клиренс вещества X (мл/мин). Долю реабсорбции (R, %) клубочко вого фильтрата рассчитывали как R=100*(СКФ–минутный ди урез)/СКФ.

Концентрации АРГ и метиларгининов в плазме крови, суточ ной моче и гомогенатах почечной ткани определяли методом высо коэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуорес центной детекцией после твердофазной экстракции [Teerlink, 2007].

Вкратце, 200 мкл плазмы, мочи или депротеинизированного гомоге ната смешивали со 100 мкл 40 мкМ раствора внутреннего стандарта (гомоаргинин) и 700 мкл фосфатного буфера (pH 7.0). Эту пробу наносили на картридж Oasis MCX (1cc, 30mg, Waters, USA) для твердо-фазной экстракции основных аминокислот. Картриджи кон диционировали 1 мл метанола и 1 мл воды. После нанесения пробы на сорбент, картриджи последовательно промывали 1 мл 0.1 М HCl и 1 мл метанола. Аналиты элюировали с помощью 1 мл смеси кон центрированного аммиака/воды/метанола/1 М NaOH (10/40/50/0.5).

После упаривания раствора под током азота, аминокислоты раство ряли в 200 мкл воды и дериватизировали ортофтальдиальдегидным реагентом, содержащим 3-меркаптопропионовую кислоту. Дерива ты разделяли на колонке Luna C18(2) (3 мкм, 100x2 мм, Phenomenex, USA), объём инжекции – 20 мкл (аутоинжектор SIL-10AD, Shimadzu, Japan). В качестве подвижной фазы использовали 50 мM KH2PO4 буфер (pH 6.5) содержащий 8.7% ацетонитрила при скоро сти потока 0.2 мл/мин (насос LC-10ADvp, Shimadzu, Japan) и темпе ратуре колонки 45оС. Флуоресцентную детекцию аналитов прово дили детектором RF-10A (Shimadzu, Japan) на волнах возбуждения – 340 нм, эмиссии – 455 нм. После выхода последнего аналита колон ку промывали 25% ацетонитрилом в буфере. Расчёт концентраций аналитов осуществляли по отношению площадей пиков стандарт ных и исследуемых образцов с поправкой на внутренний стандарт (софт LCSolution, Shimadzu, Japan).

Активность ДДАГ в почечной ткани определяли прямым изме рением количества АДМА, метаболизированного ферментом [Nona ka et al., 2006]. Гомогенат разделяли на две части: к 90 мкл гомоге ната и 180 мкл 0.1 М Na2HPO4 буфера (pH 6.5) добавляли 30 мкл мкМ АДМА. Для инактивации ДДАГ в одну из пробирок немедлен но добавляли 30 мкл 30% 5-сульфосалициловой кислоты (ССК), за тем инкубировали на водяной бане 60 мин при 37oC. В этой пробир ке активность ДДАГ образца принималась равной 0. Другую про бирку с гомогенатом инкубировали 60 мин при 37oC перед тем, как добавить 30% ССК. Затем все образцы центрифугировали 10 мин при 9100g и 4oC. Супернатант подвергался процедуре твёрдофазной экстракции и ВЭЖХ анализу, описанным выше. Активность ДДАГ выражали как снижение количества АДМА (пмоль) за минуту на мг белка при 37oC. Концентрацию белка в образцах определяли мето дом Бредфорда [Bradford, 1976].

Продукцию АРГ в почечной ткани оценивали способом, подоб ным определению активности ДДАГ, но без использования экзоген ного АДМА. Скорость синтеза АРГ выражали как увеличение коли чества АРГ (пмоль) за минуту на мг белка при 37oC.

Нитрит-ионы определяли реакцией Грисса [Navarro-Gonzlvez et al., 1998]. 150 мкл образца помещали в лунку 96-луночной план шеты, последовательно добавляли 75 мкл 60 мМ раствора сульфа ниламида (в 7% HCl) и 75 мкл 0.77 мМ нафтилэтилендиамина ди гидрохлорида (NEDA). Спустя 5 мин определяли поглощение света образцом на длинах волн 540 нм и 630 нм в бихроматическом режи ме (ELx 808iu, Bio-Tek, USA). Нитрат-ионы восстанавливали до нитрит-ионов гранулами кадмия (Cd), покрытыми медью [Navarro Gonzlvez et al., 1998]. Все образцы депротеинизировали раствором ZnSO4 [Ghasemi et al., 2007]. К 250 мкл супернатанта добавляли мкл 0.2 М глицин-NaOH буфера (pH 9.7). В пробирку с образцом помещали 4 гранулы (d~2мм) покрытого медью Cd и встряхивали мин. Затем образец переносили в чистую пробирку и центрифугиро вали 7 мин при 12000g. Супернатант забирали для определения нит рит-иона. Для покрытия медью, гранулы Cd трижды промывали де ионизованной водой и помещали в 5 мМ раствор CuSO4 на 5 мин.

Помешивали на протяжении всей инкубации. Затем дважды промы вали глицин-NaOH буфером, подсушивали и сразу использовали.

Анализ данных осуществляли при помощи пакета Statistica (StatSoft, USA). Данные представлены как M±SE. Нормальность распределения оценивали критерием Колмогорова-Смирнова. Зна чимость различий средних значений между группами определяли t тестом для независимых выборок. Различия считали статистически значимыми при p0.05. Корреляционный анализ проводили по всей выборке с использованием линейного коэффициента Пирсона.

Результаты исследования и их обсуждение Экскреторная функция почек при острой почечной недоста точности Внутримышечная инъекция 10 мл/кг 50% раствора глицерина значительно нарушала экскреторную функцию почек. Спустя 72 ч после введения глицерина в суточной моче животных значимо уменьшались количества креатинина и мочевины (рис. 1). СКФ, рассчитанная по клиренсу эндогенного креатинина, и почечный клиренс мочевины были также снижены (рис. 2).

б) а) а) б) 12 1,2 1, ммоль / 24 ч моль / 24 ч мл / мин мл / мин 0,8 0, * 0,4 0, * * * 0,0 0, КО КО КО КО Рис. 1. Количество креатинина (а) и Рис. 2. Почечный клиренс креатинина мочевины (б), экскретированное с (а) и мочевины (б) у животных кон мочой за сутки у животных кон- трольной группы (К) и при острой трольной группы (К) и при острой почечной недостаточности (О). Дан почечной недостаточности (О). Дан- ные представлены как M±m. * ные представлены как M±m. * - p0.000001 между К и О.

p0.0001 между К и О.

Данные изменения сопровождались накоплением креатинина и мочевины в плазме крови животных с ОПН (рис. 3).

Объём суточной мочи животных спустя 72 ч после индукции ОПН не отличался значимо от такового в контрольной группе (рис.

4а). Однако реабсорбция клубочкового фильтрата в этот период бы ла значимо снижена (рис. 4б).

При визуальной оценке макропрепаратов почек крыс с ОПН, полученных после забоя животных, выявлены тотальные мелко- и крупноочаговые повреждения (некроз) почечной паренхимы. Дан ные очаги поражения распространялись через всю толщу коркового вещества вплоть до мозгового вещества почки.

б) 60 б) а) а) * * * 200 мкМ мМ мл % 100 20 0 0 КО КО КО КО Рис. 3. Концентрация креатинина (а) Рис. 4. Суточный объём мочи (а) и и мочевины (б) в плазме животных реабсорбция клубочкового фильтрата контрольной группы (К) и при острой (б) у животных контрольной группы почечной недостаточности (О). Дан- (К) и при острой почечной недоста ные представлены как M±m. * - точности (О). Данные представлены p0.000001 между К и О. как M±m. * - p0.001 между К и О.

Известно, что глицерин вызывает некроз мышц (рабдомиолиз) и высвобождение миоглобина в кровь. Свободный миоглобин ока зывает нефротоксическое действие, образует сгустки в канальцах нефронов, а также связывает NO, вызывая интраренальную вазоко нстрикцию и ишемию почечной ткани. Гиповолемия вследствие отёка некротизированных мышц тоже вносит вклад в ишемическое повреждение почек. Все эти события в комплексе приводят к разви тию ОПН [Zager, 1996;

Bosch et al., 2009].

Наблюдаемые нами нарушения экскреторной функции почек после введения глицерина (снижение экскреции креатинина и моче вины, их аккумуляция в крови, уменьшение реабсорбции клубочко вого фильтрата) типичны для ОПН и согласуются с данными других исследователей [Айзман и соавт., 2000;

Soares et al., 2002;

Rosen berger et al., 2008].

АРГ и метиларгинины в моче при острой почечной недоста точности Концентрация АРГ и его метилированных аналогов в моче, приведенная к концентрации креатинина у животных с ОПН увели чивалась (рис. 5). АДМА в моче большинства контрольных живот ных присутствовал в концентрациях ниже порога чувствительности детектора, однако его концентрация возрастала более чем в 100 раз при ОПН.

АРГ СДМА 1,2 ММА АДМА * ** * нмоль / мкмоль Кр нмоль / мкмоль Кр нмоль / мкмоль Кр нмоль / мкмоль Кр * 1, 0, 0,8 0,4 0,4 0 0,0 0, КО КО КО КО Рис. 5. Концентрации аргинина (АРГ), монометиларгинина (ММА), симмет ричного (СДМА) и асимметричного (АДМА) диметиларгининов в моче, при веденные к концентрации креатинина (Кр) у животных контрольной группы (К) и при острой почечной недостаточности (О). Данные представлены как M±m. * - p0.05, ** - p0.005 между К и О.

Несмотря на выраженное нарушение экскреторной функции почек, суточная экскреция АРГ и метиларгининов с мочой не уменьшалась (рис. 6). Более того, количество АДМА, выводимого из организма с мочой, увеличивалось более чем в 100 раз.

1600 АРГ ММА АДМА 200 СДМА * 1200 нмоль / 24 ч нмоль / 24 ч нмоль / 24 ч нмоль / 24 ч 800 400 0 КО КО КО КО Рис. 6. Количество аргинина (АРГ), монометиларгинина (ММА), симметрич ного (СДМА) и асимметричного (АДМА) диметиларгининов в суточной моче у животных контрольной группы (К) и при острой почечной недостаточности (О). Данные представлены как M±m. * - p0.001 между К и О.

Экскретируемые фракции АРГ и его метилированных аналогов при остром повреждении почек значительно возрастали (рис. 7), и имели обратные корреляционные связи с реабсорбцией клубочково го фильтрата (r=-0,94 для АРГ, r=-0,93 для ММА, r=-0.90 для АДМА и r=-0.82 для СДМА, p0.05).

ММА СДМА АДМА АРГ ** * *** *** 40 % % % % 20 6 0 0 КО КО КО КО Рис. 7. Экскретируемые фракции аргинина (АРГ), монометиларгинина (ММА), симметричного (СДМА) и асимметричного (АДМА) диметиларгини нов у животных контрольной группы (К) и при острой почечной недостаточ ности (О). Данные представлены как M±m. * - p0.05, ** - p0.01, *** p0.005 между К и О.

Низкие значения экскретируемых фракций свидетельствуют о практически полной реабсорбции АРГ и метиларгининов у здоро вых крыс. Интересно, что экскретируемая фракция СДМА, имеюще го близкую структурную аналогию с АДМА, значительно выше, чем у последнего. Такие различия могут объясняться как более низкой реабсорбцией СДМА, так и его секрецией клетками канальца.

Пренебрежительно малое количество АДМА в суточной моче животных контрольной группы свидетельствует о том, что элими нация АДМА, образующегося в организме данных животных, пол ностью обеспечивается ферментативным гидролизом ДДАГ. Сход ные данные получены и другими авторами [Al Banchaabouchi et al., 2000;

Nijveldt et al., 2003].

На сегодняшний день в литературе нет сведений о почечной экскреции ММА у крыс. Нами впервые показано, что экскреция ММА у половозрелого самца крысы Wistar составляет около нмоль в сутки. При этом экскретируемая фракция ММА у крысы по данным нашей работы оказалась в 2.5 раза выше, чем у человека [по Torremans et al., 2003].

Примечательно, что экскреция АРГ и метиларгининов при остром повреждении почек оставалась сохранной, несмотря на низ кую СКФ. Это может быть обусловлено секрецией или нарушенной реабсорбцией данных веществ, что подтверждается значимым уве личением их экскретированных фракций при развитии ОПН, и сильными отрицательными связями с реабсорбцией клубочкового фильтрата. В модели хронической болезни почек у крыс также были обнаружены увеличение суточной экскреции АДМА и отсутствие изменений в экскреции СДМА [Al Banchaabouchi et al., 2000;

Matsu guma et al., 2006].

АРГ и метиларгинины в крови при острой почечной недоста точности Острое повреждение почек оказывало разное влияние на цир кулирующий в крови АРГ и его метилированные аналоги. Так, кон центрация АРГ в плазме крови снижалась. Уровень СДМА в крови, напротив, значительно возрастал. Концентрации ММА и АДМА в плазме при ОПН не изменялись значимо (рис. 8).

ММА СДМА АДМА АРГ 2, ** 0,6 0,6 1, мкМ мкМ мкМ мкМ 160 1, 0,3 0, * 0, 0,0 0,0 0, КО КО КО КО Рис. 8. Концентрации аргинина (АРГ), монометиларгинина (ММА), симмет ричного (СДМА) и асимметричного (АДМА) диметиларгининов в плазме крови животных контрольной группы (К) и при острой почечной недостаточ ности (О). Данные представлены как M±m. * - p0.005, ** - p0.00001 между К и О.

Корреляционный анализ выявил значимые линейные связи между уровнем СДМА в крови и маркёрами функции почек: r=0. для креатинина плазмы, r=0.95 для мочевины плазмы, и r=-0.90 для СКФ (p0.05 для всех связей). Концентрация АРГ в крови также имела связь с данными маркёрами: r=-0.78 для мочевины, r=-0. для креатинина, и r=0.63 для СКФ (p0.05 для всех связей).

В настоящее время СДМА признаётся эндогенным маркером почечной функции. Элиминация СДМА из организма осуществляет ся путём экскреции с мочой [Yudkoff et al., 1984]. В крови пациен тов с терминальной стадией ХБП обнаружено увеличение концен траций СДМА и АДМА [Vallance et al., 1992], и большинство авто ров связывают высокие уровни диметиларгининов в крови с нару шением их экскреции [Schwedhelm and Bger, 2011]. Однако, ре зультаты нашей работы свидетельствуют об увеличении продукции СДМА при повреждении почек, поскольку его концентрация в кро ви возрастала на фоне сохранной почечной экскреции.

Повышение продукции СДМА может быть связано с увеличе нием скорости распада СДМА-содержащих белков. Например, ме таболический ацидоз при уремии усиливает катаболизм белков мы шечной ткани [Mitch et al., 1989], а интраренальное воспаление и ок сидативный стресс повышают экспрессию ферментов, метилирую щих АРГ в белках почечной ткани [Matsuguma et al., 2006].

Концентрация АДМА в плазме животных после повреждения почек не изменялась значимо, а его суточная экскреция, напротив, многократно возрастала. Такие изменения могут свидетельствовать об увеличении продукции АДМА. Вероятно, что гиперпродукцию АДМА при ОПН обуславливают те же факторы, что продукцию СДМА.

Другой причиной увеличения экскреции АДМА с мочой может быть нарушение ферментативного пути элиминации этого димети ларгинина при повреждении почек. АДМА, в отличие от СДМА, подвергается гидролизу ферментом ДДАГ [Pope et al., 2009]. Пока зано, что почка содержит большое количество данного фермента [Palm et al., 2007].

ММА является предшественником АДМА и СДМА [Nicholson et al., 2009], поэтому изменения в метаболизме диметиларгининов вероятно должны были бы затрагивать и метаболизм ММА, однако этого не отмечено. Отсутствие в литературе информации о ММА за трудняет интерпретацию полученных нами результатов. По видимому, интенсивность монометилирования и диметилирования АРГ в белках регулируется независимо. Однако механизмы, контро лирующие интенсивность диметилирования АРГ, до настоящего времени не исследованы.

Повреждение почек затрагивало метаболизм АРГ, о чём гово рит снижение концентрации АРГ в плазме на фоне его неизменной суточной экскреции с мочой. Низкий уровень циркулирующего в крови АРГ также был зарегистрирован в модели ОПН, индуциро ванной уранил-нитратом [Schramm et al., 2002] и у пациентов с ХБП [Schramm et al., 2002;

Brunini et al., 2006]. Вероятной причиной уменьшения концентрации АРГ в крови может быть нарушение его продукции в почке. Известно, что клетки проксимальных канальцев почки являются основным местом продукции АРГ в организме мле копитающих [Dhanakoti et al., 1990]. Этот метаболический путь служит важным источником циркулирующего в крови АРГ [Feather son et al., 1973].

Изменения в метаболизме АРГ и метиларгининов приводили к снижению количества АРГ на единицу его метилированных анало гов в плазме крови. Так, соотношение АРГ/(АДМА+ММА) снижа лось со 151.91±18.69 до 108.55±5.13, p0.05. Данное соотношение субстрата и ингибиторов NOS отражает биодоступность NO. Пока зано, что снижение величины АРГ/АДМА в крови крыс ассоцииру ется с уменьшением тока крови через почки, печень и селезёнку [Richir et al., 2009].

Содержание АРГ и метиларгининов в почечной ткани при острой почечной недостаточности Концентрация АРГ в ткани почки животных обеих групп была на несколько порядков выше, чем концентрации метиларгининов.

Спустя 72 ч после индукции ОПН наблюдалось значимое снижение концентраций АРГ и его метилированных аналогов: уровень АРГ уменьшался на 66.4±2.4%, ММА на 40.6±6.4%, АДМА на 58.0±7.9% и СДМА на 59.6±1.1%, p0.00001 (рис. 9). В тоже время концентра ция общего белка в образцах ткани была выше, чем у контрольной группы (11.4±0.34 и 9.38±0.32 соответственно, p0.005).

Корреляционный анализ выявил значимые линейные связи между концентрациями анализируемых веществ в почечной ткани и маркёрами почечной функции. Так, r=0.80 для СКФ и АРГ, r=0. для СКФ и ММА, r=0.84 для СКФ и АДМА, r=0.91 для СКФ и СДМА (p0.05 для всех связей).

ММА АДМА АРГ СДМА нмоль / г ткани нмоль / г ткани нмоль / г ткани нмоль / г ткани * * * 1500 * 0 0 КО К О КО КО Рис. 9. Концентрации аргинина (АРГ), монометиларгинина (ММА), симмет ричного (СДМА) и асимметричного (АДМА) диметиларгининов в почечной ткани животных контрольной группы (К) и при острой почечной недостаточ ности (О). Данные представлены как M±m. * - p0.00001 между К и О.

Изменение уровня АРГ и метиларгининов в почечной ткани при ОПН приводило к уменьшению количества АРГ на единицу его метилированных аналогов. Так, АРГ/(АДМА+ММА) снижалось с 40.31±2.92 до 32.22±2.11, p0.05. При этом было уменьшено коли чество каждого диметиларгинина на единицу своего предшествен ника (ММА), а соотношение АДМА/СДМА не менялось. Такие из менения отражают усиленную (по отношению к диметиларгининам) продукцию ММА.

Уменьшение содержания АРГ в почечной ткани также показа но на модели ОПН, индуцированной уранил-нитратом [Schramm et al., 2002]. Недостатком АРГ в почечной ткани, вероятно, объясняет ся феномен усиленного захвата АРГ из системного кровотока поч кой после ишемии [Prins et al., 2002], тогда как в физиологических условиях этот орган, напротив, служит источником циркулирующе го в крови АРГ [Featherson et al., 1973].

Снижение концентраций АРГ и метиларгининов в ткани почки может быть следствием нарушенной реабсорбции аминокислот по вреждёнными канальцами нефрона и/или уменьшения синтеза АРГ почкой. Возможно также, что свободные метиларгинины высвобож даются из почечной ткани в системную циркуляцию при поврежде нии почки. Такое предположение согласуется с исследованием, про демонстрировавшим, что почка в реперфузионный период после су праренального клипирования аорты «переключается» с утилизации диметиларгининов из системного кровотока на их выброс в цирку ляцию [Yeung et al., 2011].

Активность ДДАГ и продукция АРГ в ткани почки при острой почечной недостаточности ДДАГ ткани почки животных контрольной группы расщепляла АДМА со скоростью 119.1±8.4 пмоль/мин/мг белка. Активность этого фермента у животных с ОПН была значительно ниже (рис.

10а).

Скорость продукции АРГ в почечной ткани животных кон трольной группы составляла 399.6±49.6 пмоль/мин/мг белка. По вреждение почек также сопровождалось выраженным снижением синтеза АРГ тканью почки (рис. 10б).

а) ДДАГ б) АРГ Рис. 10. Активность диме тиларгинин диметиламино пмоль / мин / мг пмоль / мин / мг гидролазы (ДДАГ) и про дукция аргинина (АРГ) в белка белка 80 почечной ткани животных контрольной группы (К) и * при острой почечной недо * статочности (О). Данные представлены как M±m. * 0 0 p0.01 между К и О.

КО КО Корреляционный анализ выявил значимые линейные связи между активностью ДДАГ, скоростью продукции АРГ в почечной ткани и маркёрами почечной функции. Так, r=0.89 для СКФ и ак тивности ДДАГ, r=0.81 для СКФ и скорости продукции АРГ (p0. для обеих связей). В то же время, активность ДДАГ и продукция АРГ в почечной ткани не имели значимых линейных связей с уров нем циркулирующих в крови АДМА и АРГ. Однако, активность ДДАГ коррелировала отрицательно с параметрами экскреции АД МА с мочой.

В литературе представлены единичные работы, касающиеся ДДАГ при повреждениях почек. Однако они свидетельствуют о во влечении этого фермента в патологию. Показано, что реперфузия почки крыс, подвергавшейся 45 мин ишемии, сопровождается сни жением активности ДДАГ и экспрессии ДДАГ-I в почечной ткани [Li Volti et al., 2008].

Подавление активности ДДАГ в почке, вероятно, обусловлено интраренальным воспалением, оксидативным стрессом и деструк цией эпителия канальцев. Показано, что ДДАГ очень чувствительна к оксидативному стрессу [Murray-Rust et al., 2001]. Ещё одним ме диатором, участвующим в подавлении ферментативного гидролиза АДМА при повреждении почек может быть ангиотензин II [Chen et al., 2007;

Onozato et al., 2008].

Примечательно, что выраженное снижение активности ДДАГ не оказывало значимого влияния на концентрацию АДМА в плазме крови. Многие исследователи полагают, что уровень циркулирую щего в крови АДМА главным образом регулируется ДДАГ [Palm et al., 2007;

Leiper and Nandi, 2011]. Одной возможной причиной, по которой концентрация АДМА в плазме крови крыс с ОПН остава лась неизменной, может быть его нарушенная реабсорбция в повре ждённых канальцах. Вследствие такого нарушения не гидролизо ванный АДМА экскретировался с мочой, а не накапливался в плаз ме. Это предположение подкрепляется обнаруженной сильной об ратной корреляционной связью между активностю ДДАГ, экскрети рованной фракцией и количеством экскретированного АДМА. Воз можно также компенсаторное повышение экспрессии и/или актив ности ДДАГ в других органах, например, в печени. Однако работ, прямо демонстрирующих такой механизм при патологии in vivo, в литературе не представлено.

Интересно, что при ОПН количество АДМА в суточной моче становилось равным количеству ММА. Концентрации данных ве ществ в крови также были примерно равными. Можно заключить, что ММА и АДМА в организме крыс образуются в сопоставимых количествах. Полученные данные также подтверждают предполо жение о том, что при подавлении активности ДДАГ в почке с мочой экскретировался тот АДМА, который в физиологических условиях подвергался ферментативной деградации.

Полученные данные позволяют полагать, что активность ДДАГ в ткани почки не играет значимой роли в элиминации ММА у крыс, поскольку связь между почечным клиренсом ММА и активностью ДДАГ отсутствовала. В то же время, активность ДДАГ отрицатель но коррелировала с клиренсом АДМА (r=-0.72, p0.05).

Снижение продукции АРГ почечной тканью при ОПН обу словлено рядом факторов: разрушением клеток почечных каналь цев, подавлением активности ферментов ASS и ASL, дефицитом ре абсорбции цитруллина (субстрата для синтеза АРГ). Возможно так же усиление утилизации АРГ в креатин или агматин, но не в орни тин, поскольку активность аргиназы в почке при глицериновой ОПН снижается [Aydogdu et al., 2006]. Использованный нами способ измерения продукции АРГ позволяет оценить конечный результат совокупности процессов синтеза и деградации АРГ, однако не даёт информации о вкладе отдельных процессов в его продукцию.

Отсутствие значимой связи между продукцией АРГ и его кон центрацией в крови свидетельствует о влиянии и других факторов на уровень АРГ в системном кровотоке. Например, усиленный за хват АРГ клетками печени [Perez et al., 1977] или эритроцитами [Brunini et al., 2006] при уремии. Усиление метилирования АРГ содержащих белков, вероятно, также вносит вклад в уменьшение циркулирующего АРГ. Об этом говорит снижение количества АРГ на единицу метиларгининов в плазме крыс с ОПН.

Конечные метаболиты оксида азота в моче и крови при острой почечной недостаточности Концентрация нитрит/нитрат-ионов (NOX) в моче, приведенная к концентрации креатинина и их суточная экскреция с мочой значи тельно снижались при повреждении почек (рис. 11).

а) Рис. 11. Концентрация (а) б) суммарных нитрит/нитрат мкмоль / мкмоль Кр 0,15 ионов в моче, приведенная к мкмоль / 24 ч концентрации креатинина 8 (Кр) и их суточная экскреция 0, (б) у животных контрольной * группы (К) и при острой по 0, чечной недостаточности (О).

* Данные представлены как 0,00 0 M±m. * - p0.01 между К и КО КО О.

Обнаружены линейные связи между экскрецией NOX и марке рами функции почек: r=0.85 для СКФ r=-0.81 для мочевины, и r= 0.80 для креатинина (p0.05 для всех связей). Также выявлены зна чимые связи между экскрецией NOX и активностью ДДАГ (r=0.90, p0.05) и продукцией АРГ (r=0.85, p0.05) в ткани почки.

В то же время, острое повреждение почек не оказывало значи мого влияния на концентрацию NOX в плазме крови: 23.69±10. мкМ в контрольной группе против 12.60±6.54 мкМ при ОПН, p=0.377.

Характерной чертой повреждения почек, индуцированного рабдомиолизом, является интраренальная вазоконстрикция и сни жение почечного кровотока. Дефицит вазодилататора NO за счёт его связывания с миоглобином [Zager, 1996] в микроциркуляторном русле и эндотелиальная дисфункция ренальных сосудов [Bonventre and Weinberg, 2003] играют важную роль в уменьшении почечного кровотока. Мы, наряду с другими авторами [Valdivielso et al., 2000;

Tsikas, 2005;

Chander and Chopra, 2006], использовали суточную экскрецию NOX с мочой как показатель синтеза NO во всём орга низме и обнаружили снижение его продукции при остром повре ждении почек.

Повреждение почек в нашей работе сопровождалось уменьше нием количества субстрата NOS (АРГ) на единицу её ингибиторов (АДМА и ММА) как в ткани почки, так и в крови. Такое изменение, может, наряду с другими факторами, обуславливать прегломеруляр ную вазоконстрикцию, эндотелиальную дисфункцию и снижение продукции NO почечными клубочками, характерные для глицери новой модели повреждения почек [Valdivielso et al., 2000;

Bonventre and Weinberg, 2003]. Экзогенный АРГ, по-видимому, может компен сировать недостаток АРГ. Положительные эффекты его введения на развитие и течение ОПН неоднократно продемонстрированы [Maree et al., 1994;

Chander and Chopra, 2006], причём в основе эффектов АРГ лежало усиление продукции NO.

Подавление оксидативного стресса также оказывает благопри ятный эффект на острое повреждение почек [Chander and Chopra, 2006]. Данные нашей работы позволяют предположить, что одной из причин положительного эффекта антиоксидантов на ОПН может быть увеличение активности ДДАГ, однако такая гипотеза нуждает ся в дополнительной проверке.

Выводы 1. Количество аргинина, монометиларгинина и симметричного диметиларгинина в суточной моче не изменялось при глицериновой острой почечной недостаточности, что свидетельствует об отсут ствии влияния острого повреждения почек на почечную экскрецию аргинина, монометиларгинина и симметричного диметиларгинина.

2. Ферментативный гидролиз асимметричного диметиларгинина диметиларгинин диметиламиногидролазой (основной путь элими нации асимметричного диметиларгинина) в почечной ткани снижа ется при глицериновой острой почечной недостаточности. Концен трация асимметричного диметиларгинина в крови при этом не изме няется, а его количество, экскретируемое с мочой, возрастает, что говорит о компенсаторной активации альтернативного пути элими нации асимметричного диметиларгинина (почечной экскреции).

3. Концентрация симметричного диметиларгинина в плазме кро ви при глицериновой острой почечной недостаточности возрастала на фоне его неизменной почечной экскреции, что свидетельствует об увеличении продукции симметричного диметиларгинина в орга низме при остром повреждении почек.

4. Концентрация монометиларгинина в плазме крови и его суточ ная экскреция с мочой при глицериновой острой почечной недоста точности не изменялись, что указывает на отсутствие влияния острого повреждения почек на метаболизм монометиларгинина.

5. За счет снижения продукции аргинина поврежденной тканью почки изменяется баланс субстрат/ингибиторы NO-синтазы, что ре гистрируется как уменьшение отношения АРГ/(ММА+АДМА).

Нарушение этого баланса приводит к снижению биодоступности оксида азота как в ткани почки, так и в целом организме.

6. Суточная экскреция с мочой конечных стабильных метаболи тов оксида азота (нитрит- и нитрат-ионов) снижается при остром повреждении почек, что свидетельствует об угнетении синтеза ок сида азота в организме.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Asymmetric dimethylarginine level varies considerably in urine but not in blood during ARF of rat / M. Gilinsky, R. Sukhovershin, G.

Petrakova // XLVII ERA-EDTA Congress. June 25-28, 2010. Munich, Germany. [

Abstract

Su167] 2. Methylarginines correlate with serotonin in the blood of hemodialy sis patients / M.A. Gilinsky, S.I. Anokhin, T.V. Latysheva, S.A.

Koroleva, G.M. Petrakova, M.V. Popov, R.A. Sukhovershin // V Sym posium on ADMA «ADMA: Bench to bedside and back;

exploring new paradigms». November 11-12, 2010. Chikago, Illinois. [Abstract #7] 3. Plasma ADMA does not reflect acute renal failure in the rat / R.A.

Sukhovershin, M.A. Gilinsky // V Symposium on ADMA «ADMA:

Bench to bedside and back;

exploring new paradigms». November 11-12, 2010. Chicago, Illinois. [Abstract #17] 4. Метиларгинины в эндогенной регуляции биодоступности ок сида азота / М.А. Гилинский, Т.В. Латышева, Г.М. Петракова, Р.А.

Суховершин // Тез. докл. XXI съезда физиол. общества им. И.П.

Павлова. – Москва-Калуга. – 2010. – С. 143.

5. Особенности эндогенной регуляции в системе оксида азота при острой почечной недостаточности / Р.А. Суховершин, М.А. Гилин ский // Тез. докл. XXI съезда физиол. общества им. И.П. Павлова – Москва-Калуга. – 2010. – С. 588.

6. Метиларгинины у крыс в глицериновой модели острой почеч ной недостаточности / М.А. Гилинский, Р.И. Айзман, Г.А. Коро щенко, Т.В. Латышева, Т.И. Новоселова, Г.М. Петракова, Р.А. Су ховершин, М.А. Cуботялов // Бюлл. СО РАМН. – 2010. – Т. 30. – № 4. – С.82-86.

7. Диметиларгинины в глицериновой модели острой почечной недостаточности у крыс / М.А. Гилинский, Р.А. Суховершин // Медицинский академический журнал. – Т. 10. – № 5. – 2010. – С. 10 11.

8. Активность диметиларгинин диметиламиногидролазы и про дукция аргинина в почечной ткани при миоглобинурической острой почечной недостаточности / Р.А. Суховершин, М.А. Гилинский // Материалы конкурса молодых ученых ФГБУ «НИИ физиологии»

СО РАМН. – 2012. – С. 4.

9. Эндогенные регуляторы биодоступности оксида азота при острой почечной недостаточности у крыс / Р.А. Суховершин, М.А.

Гилинский // Бюл. эксперим. биол. мед. – 2012. – Т. 153. – № 4. – С.

430-434.

Роль асимметричного диметиларгинина в регуляции уров 10.

ня оксида азота при остром повреждении почек у крыс / Р.А. Сухо вершин, М.А. Гилинский // Рос. Физиол. журн. им. И.М. Сеченова.

– 2012. – Т. 98. – № 4. – С. 497-505.

11. Влияние миоглобинурической почечной недостаточности на продукцию оксида азота у крыс / Р.А. Суховершин // Бюлл. СО РАМН. – 2012. – Т. 32. – № 3. – С.131-135.

Список сокращений АДМА асимметричный диметиларгинин АРГ аргинин ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография ДДАГ диметиларгинин диметиламиногидролаза ММА монометиларгинин ОПН острая почечная недостаточность СДМА симметричный диметиларгинин ССК 5-сульфосалициловая кислота ХБП хроническая болезнь почек кадмий Cd оксид азота NO NOS NO-синтаза суммарные нитрит- и нитрат-ионы NOX Соискатель Суховершин Р.А.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.