авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Научно-практические аспекты технологии модификации растительных масел для жировых продуктов с функциональными свойствами

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Шеламова Светлана Алексеевна НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТЕХНОЛОГИИ МОДИФИКАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ ДЛЯ ЖИРОВЫХ ПРОДУКТОВ С ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ Специальность 05.18.06 – Технология жиров, эфирных масел и парфюмерно-косметических продуктов

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

Научный консультант: доктор технических наук, профессор Тырсин Юрий Александрович

Официальные оппоненты: Кривова Анна Юрьевна, доктор технических наук, профессор, Научный Центр ОАО «Свобода», зав. лабораторией Бутова Светлана Николаевна, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Московский государствен ный университет пищевых производств», зав. кафедрой «Технология продуктов био органического синтеза» Султанович Юрий Аврамович, доктор химических наук, профессор, ООО УК «Солнечные продукты», советник генерального директора

Ведущая организация: ОАО «ГосНИИсинтезбелок»

Защита состоится «25» декабря 2012 года, в 11 часов на заседании диссертаци онного совета Д 212.122.05 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет технологий и управления им. К. Г. Разумовского», по адресу:

109029, г. Москва, ул. Талалихина, дом 31, ауд. 13 (первый этаж).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет технологий и управления им. К. Г. Разумовско го»

Автореферат разослан: « » ноября 2012 г.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайтах ВАК РФ Мини стерства образования и науки РФ http://vak2.ed.gov.ru/catalogue и ФГБОУ ВПО МГУТУ им. К.Г. Разумовского http://mgutm.ru/graduates-and-doctors/

Ученый секретарь диссертационного совета Козярина Г. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В перспективах развития масложирового комплекса России важное место отводится вопросам повышения качества и безопасности продукции, что соответствует положениям Доктрины продовольственной без опасности Российской Федерации;

государственной политике в области здоро вого питания населения на период до 2020 года, в число основных задач кото рой включено развитие производства продуктов функционального назначения, внедрение био- и нанотехнологий. К таким инновационным технологиям отно сится энзимная переэтерификация природных масел для получения специали зированных жиров. Этот способ одновременно ограничивает использование химических реагентов в производственных процессах, загрязнение окружаю щей среды и обеспечивает удовлетворение готовых продуктов требованиям здорового питания по содержанию насыщенных триацилглицеролов и транс изомеров жирных кислот.

В последние годы специализированные жиры занимают значительный объем масложировой отрасли как рецептурные ингредиенты для молочной, кондитерской, хлебопекарной промышленности;

углубляется дифференциация жиров под конкретные продукты. Высокая специфичность липолитических ферментов к строению жирнокислотного остатка и его положению в молекулах триацилглицеролов (ТАГ) дает возможность получать широкий спектр жиро вых продуктов как в отношении технологической функциональности, так и со ответствия научным принципам нутрициологии о роли различных жирных кис лот в питании и значении их распределения в ТАГ.

Большой вклад в формирование и развитие современных тенденций техно логии специальных жиров внесли А. П. Нечаев, Ю. А. Султанович, И. В. Пав лова, А. А. Кочеткова и другие ученые. Фундаментальные и прикладные иссле дования ферментативной модификации ТАГ представлены в работах Ю. А.

Тырсина, Л. В. Зайцевой, В. В. Мельникова, A. K. Macrae, S. Bloomer, C. E. Mar tinez, Y. Schimada, D. Zhou, T. Oba & B. Witholt и др.

Практика внедрения ферментативной технологии при переработке масел и жиров показала, что липолитические ферментные препараты должны иметь вы сокую трансферазную активность, стабильность в производственном процессе, устойчивость к технологическим факторам.

Липолитические ферменты широко распространены в организмах различ ного уровня биологической организации, но решить технологические задачи возможно только с помощью их микробного синтеза. Работы по скринингу продуцентов, получению активных генетически модифицированных штаммов микроорганизмов, изучению свойств липаз, их иммобилизации активно прово дятся учеными различных стран. Исследования отечественных авторов (Е. Л.

Рубан, Л. О. Северина, Г. Б. Ксандопуло, К. Д. Давранов, Ю. А. Свириденко, И.

М. Арендс, Ж. Х. Диеров, А. Ю. Кривова и др.) проводились с целью использо вания липаз для гидролиза масел и жиров. Количество работ, посвященных изучению липолитических ферментов в процессах синтеза в микроводных условиях крайне ограничено (Ю. А. Тырсин, К. Д. Давранов). В крупномас штабном производстве специализированных жиров в России используются ферментные препараты липаз зарубежных фирм. В связи с перспективами дан ных технологий получение отечественных препаратов липаз со свойствами, не обходимыми для эффективного осуществления биомодификации жиров, – важ ная и насущная проблема.

Диссертационная работа направлена на решение важной народнохозяй ственной задачи – разработку научно обоснованных технологических решений биомодификации растительных масел, реализация которых отвечает современ ным тенденциям развития науки и технологий, ориентированных на создание экологически чистых производств, в частности, масложировых продуктов функционального назначения.



Работа проводилась в соответствии с планом НИР ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» по теме «Биосинтез микроорганизмами биологически активных веществ и исследование их физико химических свойств» (номер гос. регистрации 01930004491), в рамках пробле мы «Модификация сорбентов путем иммобилизации ферментов и других фи зиологически активных веществ», утвержденной Координационным планом Научного Совета РАН, выполняемой в ФГБОУ ВПО «Воронежский государ ственный университет»;

на кафедре органической и пищевой и биохимии ФГБОУ ВПО «МГУПП».

Цель и задачи исследований. Цель настоящего исследования заключа лась в научном обосновании и практической реализации разработанной техно логии модификации растительных масел на основе ферментативного гидролиза и переэтерификации ТАГ для получения функциональных жировых продуктов с определенными технологическими и физиологическими свойствами.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

- скрининг активного продуцента микробных липаз, удовлетворяющих требованиям направленной конверсии жиров и масел, и микробных продуцен тов внеклеточных липоксигненаз;

- изучение особенностей регуляции биосинтеза изоферментов внеклеточ ного липолитического комплекса выбранного продуцента;

- разработка технологии получения препаратов липаз с различной степе нью очистки и исследование физико-химических и каталитических свойств вы деленных изоферментов липазы;

- идентификация функциональных групп активного центра липаз;

- разработка приемов иммобилизации липазы на различных носителях и изучение свойств иммобилизованных препаратов;

- исследование кинетических параметров реакций гидролиза и трансэтери фикации в водной и органической средах, катализируемых иммобилизованной липазой;

- разработка технологии получения жировых продуктов с функциональ ными свойствами на основе ферментативных процессов этерификации, глице ролиза, ацидолиза;

- разработка технологии хлебобулочных изделий с использованием моди фицированных жиров;

- проведение производственных испытаний разработанных технологий на предприятиях масложировой и хлебопекарной промышленности.

Научная концепция. Научная концепция состоит в разработке научно практических аспектов технологии модификации растительных масел на основе ферментативного гидролиза и переэтерификации для получения функциональ ных жировых продуктов посредством использования ферментов липаз и липок сигеназ, включающего выбор липолитического фермента с высокой гидролити ческой и трансацилирующей активностью, получение ферментных препаратов липазы и липоксигеназы, изучение каталитических свойств липазы, иммобили зацию липазы, выявление закономерностей ферментативных процессов гидро лиза и трансэтерификации ацилглицеролов в водной среде и в системах с орга ническими растворителями, оценку факторов, определяющих соотношение продуктов трансэтерификации, обоснование использования жиров, модифици рованных липазой и липоксигеназой, в технологии пищевых производств.

Основные положения, выносимые на защиту.

На защиту выносятся следующие положения:

- методологический подход к оценке эффективности использования липо литических ферментов для модификации растительных масел на основе сово купности экспериментальных исследований каталитических свойств липаз;

- особенности биосинтеза липаз и липоксигеназ микроорганизмами;

- представление механизма действия липаз;

- специфичность действия липаз (позиционная, к жирным кислотам) при гидролизе и этерификации в микроводных условиях и в системах с органиче скими растворителями;

- кинетические и термодинамические характеристики адсорбции липазы при иммобилизации;

- кинетические параметры ферментативного гидролиза и трансэтерифика ции;

- технологические решения по использованию липазы и липоксигеназы в хлебопечении;

- оценка эффективности использования липазы для получения жировых продуктов с функциональными свойствами.

Научная новизна. Научно обоснован выбор ферментов липаз и липокси геназ с целью модификации растительных масел для получения функциональ ных жировых продуктов и имеющих перспективы использования в технологии пищевых производств.

С целью интенсификации процессов гидролиза и переэтерификации расти тельных масел, совершенствования технологии хлебобулочных изделий и по вышения их качества экспериментальным путем выявлены штаммы микро мицетов с высоким уровнем синтеза внеклеточных липазы (Rhizopus oryzae 1403), липоксигеназы (Rh. oryzae 605) и комплекса этих ферментов (Rh. micro sporus var. chinensis 1062).

На основе анализа факторов, влияющих на биосинтез липаз при культиви ровании микромицета Rh. оryzae 1403, установлено, что им синтезируется ком плекс липолитических ферментов.

Впервые получены в гомогенном виде изоформы Липаза I и Липаза II, оха рактеризованы их биохимические, физико-химические и каталитические свой ства. Определение кинетических параметров реакций гидролиза и трансэтери фикации триацилглицеролов и ингибиторный анализ позволили выявить функ циональные группы активного центра ферментов. На основании собственных экспериментальных и данных литературы предложена модель механизма дей ствия липаз.

Впервые установлена специфичность изоформ липаз Rh. оryzae 1403 к строению ацильного остатка и его положению в триацилглицеролах как при гидролизе, так и при этерификации.

Установлены особенности иммобилизации липазы на различных носите лях. Определены кинетические и термодинамические характеристики адсорб ции фермента на гидрофобном сорбенте – стиросорбе, которые показали высо кое аффинное сродство липазы к сорбенту.

Проведен комплексный анализ кинетических параметров реакций гидро лиза, этерификации, глицеролиза, ацидолиза иммобилизованным препаратом липазы в водной и органической средах;

установлены общие закономерности проведения ферментативной конверсии ацилглицеролов.

В рамках обоснования целесообразности использования жиров и масел, частично гидролизованных липазой, при изготовлении хлебобулочных изделий, выявлены особенности их влияния на свойства клейковины, крахмала, жизне деятельность дрожжей;

на технологические параметры и качество готовых из делий.

Впервые определены факторы, влияющие на соотношение и выход про дуктов в процессах этерификации, глицеролиза и ацидолиза, катализируемых липазой Rh. оryzae 1403, в водной и органических средах.

Новизна исследований защищена 1 авторским свидетельством и 3 патен тами.

Практическая значимость. Полученный экспериментальный материал позволил сформировать рекомендации по практическому приложению микроб ных липаз и липоксигеназ;

определить рациональные условия проведения фер ментативных процессов гидролиза и трансэтерификации триацилглицеролов для модификации жиров и масел и области практического использования полу чаемых продуктов конверсии.

Разработана технология культивирования продуцента липазы Rhizopus ory zae 1403 и технология ферментного препарата липазы с высоким выходом –62, % и активностью 27,5 ед./мг. Способ биосинтеза липазы запатентован (Патент 2397247 РФ).

Получен иммобилизованный препарат липазы, отличающийся высокой трансферазной активностью – 385 ед./г и стабильностью в органических рас творителях. Высокая активность препарата, позиционная специфичность и ши рокий спектр сродства к жирным кислотам позволили рекомендовать его для получения разнообразных продуктов путем энзимной переэтерификации.

Установлены режимы проведения гидролиза жировых продуктов, позво ляющие получить жиры с функциональными свойствами для технологии хле бопечения. Разработаны технологии хлебобулочных изделий на основе фер ментированных жиров и сдобных изделий с использованием липазы и расти тельной липоксигеназы (А.С. 1405130). Производственные испытания этих технологий на хлебозаводах (г. Воронеж) булочно-кондитерском комбинате (г.

Санкт-Петербург) подтвердили получаемый положительный эффект. Получен диплом 4-й Международной выставки «Современное хлебопечение. Сладкоеж ка–2000», г. Воронеж.

Получен препарат липоксигеназы, отличающийся высокой активностью и низким уровнем окисления -каротина (Патент 2233324 РФ);

комплексный препарат липазы и липоксигеназы с высокой активностью обоих ферментов (Патент 2233325 РФ). Эти препараты рекомендованы для использования в хле бопекарной промышленности.

Показана перспективность использования иммобилизованной липазы Rhi zopus oryzae 1403 для получения жиров с повышенным содержанием моно- и диацилглицеролов (МАГ и ДАГ) путем этерификации или глицеролиза расти тельных масел.

Доказана возможность получения низкокалорийных жиров с помощью ацидолиза растительных масел. Оптимизирован процесс ацидолиза подсолнеч ного масла с каприновой кислотой, что позволило увеличить включение кисло ты до 91,8 % от максимального возможного и сократить длительность процесса в 2–3 раза.

Предлагаемые технологии модификации растительных масел успешно апробированы в производственных условиях на предприятии ЗАО «ГК Масло продукт» (г. Воронеж).

Личный вклад соискателя. Личное участие автора являлось основопола гающим на всех стадиях работы и состояло в формировании научных направ лений, постановке задач и целей исследований, организации эксперимента, анализе и обработке результатов, подготовке материалов к опубликованию, проведении производственных испытаний.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на 35-ти научных конференциях, в том числе: на симпозиуме «Био технология микробов» (Москва, 2004);

на Всероссийском конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2009);

на международных и всесоюзных конференциях: «Техника и технология пищевых производств» (Могилев, 1998, 2005), «Биотехнологические процессы переработки сельскохо зяйственного сырья» (Москва, 2002), «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2009, 2010), «Технологии и продукты здорового питания. Функцио нальные пищевые продукты» (Москва, 2009), «Управление торговлей: теория, практика, инновации» (Москва, 2009), «Аналитические методы измерений и приборы в пищевой промышленности. Экспертиза, оценка качества, подлинно сти и безопасности пищевых продуктов» (Москва, 2009), «Идентификация фальсифицированных пищевых продуктов. Контроль содержания и безопасно сти наночастиц в продукции сельского хозяйства и пищевых продуктах» (Москва, 2009), «Потребительский рынок: качество и безопасность товаров» (Орел, 2010), «Актуальные проблемы потребительского рынка товаров и услуг» (Киров, 2009, 2011), «Потребительский рынок: качество и безопасность това ров» (Орел, 2011), «Новости научной мысли» (Прага, 2011), «Наука и техноло гии: шаг в будущее» (Прага, 2012).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 72 работы, в том числе 16 статей в журналах, рекомендованных ВАК;

2 монографии;

получено 1 авторское свидетельство и 3 патента РФ на изобретения.

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, выводы, список использованной литературы и приложения. Содержание работы изложено на 318 страницах ос новного текста, включающего 45 таблиц и 91 рисунок, и 8 приложений. Список литературы включает 663 источника, в том числе 451 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность решаемой проблемы, доказана необходимость проведения исследований в направлении скрининга липолити ческих ферментов с соответствующими свойствами для биоконверсии природ ных триацилглицеролов с получением жировых продуктов с функциональными свойствами.

Глава 1. Состояние проблемы и постановка задач исследования В представленном обзоре научной и технической литературы по теме дис сертации обобщены достижения, накопленные к настоящему времени в области энзимной переэтерификации ТАГ для получения специализированных жиров;

изучения липолитических ферментов микроорганизмов.

Энзимная переэтерификация не только исключает образование токсичных трансизомеров жирных кислот, но имеет ряд преимуществ со стороны техноло гической оценки готовых жировых продуктов. За счет высокой пластичности, способности кристаллизоваться в устойчивой -форме они могут быть исполь зованы в качестве жировой основы маргаринов, заменителей молочного жира, начинок для различных кондитерских изделий. Становится решаемой проблема получения заменителей какао-масла. Использование переэтерифицированных масел в технологии пшеничного хлеба позволяет улучшить реологические свойства теста, физико-химические и органолептические показатели хлеба по сравнению с применением растительных масел и традиционных маргаринов.

Ферментативная переэтерификация незаменима для получения диетиче ских жировых продуктов. Согласно современным представлениям науки о пи тании переваривание и метаболизм жиров определяется как распределением жирных кислот в молекуле ТАГ, так и соотношением молекулярных масс его компонентов. Так называемые симметричные триацилглицеролы АВА типа, где А – жирная кислота со средней цепью, а B – длинноцепочечная ненасыщенная жирная кислота, важны для больных с нарушениями пищеварения. Они чрез вычайно редки, и их трудно получить химическим синтезом. ТАГ, содержащие смешанные жирные кислоты, имеют потенциальное применение в развитии но вых клинических продуктов для парентерального или тонкокишечного питания хирургических, сильно травмированных, обожженных или септических боль ных. Большое внимание уделяется низкокалорийным жирам. Главный подход в этой технологии – это определенное распределение стеариновой кислоты и низкомолекулярных жирных кислот.

Известно создание диетических продуктов на основе ферментативного гидролиза – образующиеся диацилглицеролы (ДАГ) уменьшают факторы ате росклероза кровеносных сосудов, подавляют различные дегенеративные болез ни. Метаболизм диацилглицеринов отличается тем, что они быстрее «сгорают» вместо осаждения в жировой ткани. Технологические свойства ДАГ характери зуются эмульгирующими свойствами, что необходимо в процессе приготовле ния майонеза, молочных продуктов, в хлебопечении.





Однако множество проблем связано с использованием липаз в микровод ных и органических средах. Во-первых, это солюбилизация фермента в масле.

Во-вторых, липазы показывают более низкую скорость переэтерификации (в сотни и тысячи раз) по сравнению с гидролизом;

органические растворители могут оказывать на них отрицательное действие. Остро в этом случае стоит проблема длительного использования фермента или его восстановления. По этому предпочтение отдается иммобилизованным препаратам. Иммобилизация липаз проводится различными способами, но преимущество имеет адсорбция как наиболее простой и экономичный. Основным недостатком энзимной пере этерификации является длительность процесса. Отечественными препаратами масложировая промышленность не располагает.

Таким образом, необходимо получение липолитических ферментов с вы сокой трансацилирующией активностью, стабильностью, что позволит сокра тить длительность процессов энзимной переэтерификации жиров и улучшить экономические показатели производства. Это требует комплексной оценки ферментативных процессов и решения ряда технологических задач:

- направленный выбор продуцентов ферментов;

- определение условий получения препаратов в растворимой и иммобили зованной формах;

- исследование физико-химических свойств липаз, стабильности, специ фичности;

- разработка направлений использования полученных препаратов.

В рамках проведения комплексной оценки эффективности ферментативной модификации растительных масел были проведены серии экспериментов для установления рациональных режимов проведения различных процессов гидро лиза и трансэтерификации и разработке технологических решений по их при менению.

Общая структура исследований представлена на рис. 1.

Глава 2. Материалы и методы исследований Объектами исследования служили микромицеты различных родов, фер менты липаза и липоксигеназа, продуцируемые этими микроорганизмами. В работе использованы различные общепринятые и специальные методы иссле дования – микробиологические, физические, физико-химические, Скрининг активных продуцентов липаз и Rhizopus oryzae 605 Препарат липоксигеназы липоксигеназ Rhizopus oryzae Rhizopus microsporus Комплексный препарат Токсикологическая var. chenensis 1062 липазы и липоксигеназы Получение препаратов липазы экспертиза Г 3Х Г 10Х Иммобилизация Очистка и изучение фракционного состава Изучение Определение физико-химических свойств кинетических параметров реакций Липаза I Липаза II гидролиза и трансэтерификации иммобилизованного препарата ацилглицеролов Исследование биохимических и физико-химических свойств Производство хлебобулочных Гидролиз изделий масел и жиров Идентификация Получение жировых продуктов функциональных групп Этерификация с повышенным содержанием моно активного центра Глицеролиз и диацилглицеролов Определение жирнокислотной Ацидолиз Производство и позиционной специфичности масел низкокалорийных жиров Рисунок 1 – Структурная схема проведенных исследований биохимические, в том числе хроматография липидов (тонкослойная, газовая, высокоэффективная жидкостная), хроматография белков (гелевая и ионооб менная), спектрофотометрия, электрофорез, фотоколориметрия, а также методы оценки качества полуфабрикатов и готовых продуктов, принятые в хлебопекар ной промышленности. Исследования проводили не менее чем в 3-х кратной по вторности, обработку экспериментальных данных осуществляли методами ма тематической статистики. Для оптимизации процессов применены методы ма тематического планирования эксперимента.

Глава 3. Выбор активного продуцента липазы. Исследование особен ностей биосинтеза липолитического комплекса из Rhizopus oryzae Опыт исследования липолитических ферментов микроорганизмов показы вает, что штаммы одного и того же вида могут различаться как по уровню био синтеза, так и по свойствам фермента.

С целью получения активного продуцента липазы нами было проверено штаммов микроскопических грибов из родов Aspergillus, Rhizopus, Mucor и др.

в условиях глубинного культивирования. Чистые культуры микроорганизмов были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов и из коллекции почвенных микромицетов кафедры биологии растений и животных ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный педагогический университет».

Одновременно с липазной (ЛА) проверялась липоксигеназная активность (ЛО) с целью выявления продуцентов ферментных препаратов целевого назна чения – для хлебопечения. Положительная роль ферментов липазы и липокси геназы в приготовлении теста из пшеничной муки известна. В связи с этим пер спективна биоконверсия жировых рецептурных составляющих при совместном действии этих ферментов.

Высокая активность липазы была обнаружена у Rhizopus oryzae 1403 (49, ед./см3), липоксигеназы – у Rh. oryzae 605 (105,6 ед./см3) (Пат. 2233324 РФ);

Rh.

microsporus var. chinensis 1062 синтезировал оба фермента на достаточно высо ком уровне (ЛА=33,7 ед./см3;

ЛО=70,4 ед./см3) (Пат. 2233325 РФ).

Дальнейшие исследования посвящены продуценту липазы Rhizopus oryzae 1403. Установлено, что он образует липоксигеназу с активностью 26,1 ед./см3 и является продуцентом главным образом экзоформ ферментов, так как внутри мицелиальные ЛА и ЛО составили 3,0 и 8,5 % соответственно от внеклеточной активности.

Глубинный способ культивирования продуцента был намного эффектив нее, чем поверхностный, при котором ЛА в расчете на 1 г СВ экстракта по сравнению с фильтратом культуральной жидкости была в 55 раз меньше.

Исследования физиологических особенностей Rhizopus oryzae 1403 пока зали, что оптимальными условиями для роста и биосинтеза липазы являются температура 30 С и рНнач 7,0. Продуцент нуждался в восстановленной форме азота. Углеводы – моно-, олиго-, и полисахариды;

многоатомные спирты по давляли биосинтез липазы. Добавление в питательную среду органических ис точников азота (пептона, казеина и БВК), а также продуктов животного проис хождения (кровяной, мясо-костной и рыбной муки) значительно интенсифици ровало рост Rh. oryzae 1403 и его биосинтетическую активность. Лучшие ре зультаты получены на средах с соевой мукой, которая может быть заменена на соевый жмых;

и с рыбной мукой. На фоне среды с соевым жмыхом уровень ЛА повышали на 13–16 % некоторые соли (MgSO4, Na2HPO4), а из факторов роста – кукурузный экстракт.

Биосинтез липазы Rh. oryzae 1403 индуцировался как субстратами – триа цилглицеролами, так и продуктами их гидролиза – жирными кислотами и их производными – твинами. Активность по сравнению с пептонно-солевой сре дой увеличивалась в 2,3–4,0 раза (табл. 1).

Таблица 1 – Влияние индукторов на биосинтез липазы Rh. oryzae ЛА, ед./см Индуктор Массовая доля, % ЛА, % Среда без индуктора – 12,0 Масло оливковое 0,5 42,6 Олеиновая кислота 0,5 41,8 Линолевая кислота 0,5 27,8 Твин 20 1,0 33,6 Твин 40 1,0 43,7 Твин 60 1,0 39,3 Твин 80 1,0 47,4 На биосинтез липаз микроорганизмами могут оказывать влияние поверх ностно-активные вещества. Однако эти сведения весьма противоречивы. Ис следование влияния различных ПАВ на биосинтез липазы Rh. oryzae 1403 про водились на фоне среды с соевым жмыхом (2 %), кукурузным экстрактом (1, %), (NH4)2HPO4 (0,5 %) и подсолнечным маслом (0,5 %). Результаты, представ ленные в табл. 2, показывают, что поливиниловый спирт и фосфатидный кон центрат оказывали слабое влияние на биосинтез липазы микромищетом. Отри цательное действие проявлял бридж. Тритоны сильно отличались по эффекту.

При добавлении тритона Х-305 удалось повысить активность фермента в 3, раза.

Таблица 2 – Влияние ПАВ на биосинтез липазы Rh. oryzae Массовая доля ЛА, ед./см Наименование ПАВ ЛА, % ПАВ, % Среда без ПАВ – 66,8 Поливиниловый спирт 0,1 70,5 Фосфатидный концентрат 0,1 69,7 Тритон Х-100 0,01 90,2 Тритон Х-305 0,01 217 Тритон Х-405 0,01 63,5 Бридж 35 0,01 23,4 Бридж 58 0,01 20,1 Для некоторых продуцентов липаз установлено наличие нескольких изо форм этого фермента. Они отличаются структурой, молекулярной массой, ка талитическими свойствами, стабильностью. Множественность изоформ липаз может быть обусловлена изменениями в экспрессии генов, различным количе ством ковалентно связанных углеводов, частичным протеолизом и другими трансляционными модификациями.

Исследования состава липолитического комплекса Rh. oryzae 1403 при культивировании на средах с добавлением различных индукторов и без них по казали, что на пептонно-солевой среде и с твином 20 образовывалась одна фор ма липазы. При введении в питательную среду оливкового масла, олеиновой кислоты и других твинов синтезировалась еще одна форма липазы. Таким обра зом, с большой достоверностью можно утверждать, что микромицет Rh. oryzae 1403 способен синтезировать два липолитических фермента. По всей видимо сти, в данном случае происходит контроль на уровне экспрессии генов липазы.

На основании проведенных исследований установлено, что высокая липо литическая активность Rh. oryzae 1403 наблюдалась на среде с соевым жмыхом, подсолнечным маслом, кукурузным экстрактом, (NH4)2HPO4 и тритоном Х-305.

Оптимизация состава питательной среды с помощью математических методов планирования позволила увеличить активность комплексного препарата до 352 ед./см3, что в 7 раз выше по сравнению с исходной средой. Максимум ЛА в культуральной жидкости наблюдался к 60 ч выращивания.

Глава 4. Получение препаратов липазы Rhizopus oryzae 1403 и иссле дование их физико-химических и биохимических свойств Разработка технологий получения препаратов липазы. Препараты липазы Г3Х и Г10Х были получены на основе ультрафильтрации и осаждения органи ческими растворителями.

При ультрафильтрации потери активности составили около 2 %, степень очистки – 2,2.

Токсикологическая экспертиза этого препарата установила, что он не об ладал токсическим действием.

Исследования по осаждению липазы органическими растворителями пока зали, что на полноту выделения значительное влияние оказывает рН. Опти мальная зона находилась в пределах рН 5,5-6,0;

кроме того, при подкислении фильтрата культуральной жидкости до рН 5,5 часть балластных белков выпада ла в осадок и удельная активность увеличивалась в 1,08-1,1 раза. Всеми органи ческими растворителями липаза Rh. oryzae 1403 осаждалась монотонно с по следовательным увеличением их концентрации, соответственно, выход фер мента возрастал до определенного предела, а удельная активность снижалась (рис. 2). Анализ полученных результатов показал, что лучшим осадителем для липазы Rh. oryzae 1403 является ацетон – при концентрации его в смеси 70 % выход липазы составил 62,3 %, степень очистки – 1,88.

Значительное влияние на выход препаратов оказывала сушка. Распыли тельная сушка при температурных режимах tвх 190–195 С и tвых 85–90 С давала потери до 25 %. Поэтому температура была максимально снижена на входе до 140–145 и 70–75 С на выходе. При этом потери активности удалось довести до 11–12 % (табл. 3).

70 ЛА в осадке, % от исходной Удельная ЛА, ед./мг белка 30 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Соотношение объемов растворителя и культуральной жидкости Рисунок 2 – Влияние концентрации растворителей на осаждение липазы:

() ацетон;

() изопропанол;

() этанол;

светлые значки – ЛА в осадке, темные значки – удельная ЛА Таблица 3 – Получение препаратов липазы путем осаждения органическими растворителями Масса Распылительная сушка Сублимационная сушка Растворитель препарата, ЛА, Выход, Потери, ЛА, Выход, Потери, из 1 дм3 ед./мг % % ед./мг % % Этанол 7,6 9,8 21,3 12,0 10,7 24,4 1, Изопропанол 7,4 18,9 40,2 11,2 20,7 46,5 0, Ацетон 7,5 24,9 52,8 11,0 27,5 62,3 1, Определены оптимальные параметры процесса вакуум-сублимационной сушки: температура замораживания – минус 12 – минус 15 С, скорость охлажде ния – 0,01 С/мин, температура на стадии сублимации – 30–35 С.

Активность препаратов липазы Rhizopus oryzae 1403 Г10Х, полученных в результате осаждения фермента из ультрафильтрата культуральной жидкости ацетоном, составила 24,9 ед./мг при распылительной сушке и 27,5 ед./мг – при сублимационной. Препарат содержал незначительные примеси липоксигеназы –50 ед./г, протеазы – 7,1 ед./г и целлюлазы – 5,0 ед./г;

амилазная, глюкоамилаз ная активность не были обнаружены.

Технологическая схема получения препаратов липазы представлена на рис. 3.

Получение высокоочищенных препаратов липазы. Ферментный препарат, полученный в результате ультрафильтрации и последующего осаждения, под вергали гель-фильтрации на Sephadex G-150. Липаза элюировалась одним пи ком;

при электрофоретическом анализе в нем обнаруживалось две белковые фракции с липолитической активностью. Разделение липаз Rhizopus oryzae проводили с помощью ионообменной хроматографии на DEAE Сellulose 52.

Исходная культура Приготовление пит. среды, Компоненты сре продуцента липазы ды, пар, стериль- стерилизация, охлаждение, Rh. oryzae ный воздух выращивание Отработанный посевного материала воздух T= 30 °С, – 96–120 ч Готовый посевной Компоненты сре- материал 2–3 % Приготовление пит. среды, ды, пар, стериль стерилизация, охлаждение, ный воздух засев среды, Отработанный глубинное культивирование воздух Глубинная культура T= 30 °С, – 60 ч продуцента Осадок (биомасса, Фильтрация остатки среды) на утилизацию Фильтрат культуральной Концентрирование жидкости (Липаза Г2Х) ультрафильтрацией Ультрафильтрат на утилизацию Ультраконцентрат культуральной жидкости Липаза Г3Х Вакуум-сублимационная сушка Хроматографические методы очистки Осаждение Водно-спиртовая, органическими водно-ацетоновая растворителями (1:2,5) Гомогенные препараты смесь Липаза I и Липаза II Вакуум-сублимационная Липаза Г10Х сушка Рисунок 3 – Схема получения препаратов липазы Rh. oryzae Для элюции был применен ступенчатый градиент концентрации NaCl от 0,1 до 0, М, так как в ряде случаев он оказывался более эффективным, чем линейный.

Кроме того, в элюирующий буфер был добавлен тритон Х-305 0,1 %. Таким спо собом удалось разделить две изоформы фермента. Одна из них элюировалась раствором NaCl с концентрацией 0,1 М (фракция I), а другая – 0,7 М (фракция II). Повторная гель-фильтрация через Sephadex G-100 позволила повысить кратность очистки до 42,0 и 25,0 с выходом по активности5,8 и 8.8 % для I и II фракции соответственно (табл. 4). Далее они были названы как Липаза I и Ли паза II.

Таблица 4 – Характеристика этапов очистки липаз Rh. oryzae Липазная активность Выход, % Количе ство Степень по Этапы очистки по белка, очистки общая удельная, ед/мг актив белку мг ности Фильтрат культуральной 820 70800 86 100,0 100,0 1, жидкости Ультрафильтрация 367 69380 190 98,0 44,8 2, Осаждение 112 42340 380 59,8 15,0 4, ацетоном (1:2,5) Гель-фильтрация 42 22230 530 31,4 5,0 6, G- Хроматография I 2,9 6940 2400 9,8 0,35 27, на ДЕАЕ–52 II 6,7 11116 1650 15,7 0,82 19, Гель- I 1.14 4100 3600 5.8 0.14 42. фильтрация II 2.9 6230 2150 8.8 0.35 25. G- Молекулярная масса Липаз I и II, определенная гель-фильтрацией на Se phadex G-150 и методом электрофореза в присутствии SDS, была практически одинаковой и равнялась 44±2 кДа.

Изоэлектрические исследования изоформ липазы Rh. oryzae 1403 показали, что pI Липазы I равна 3,0, а Липазы II – 4,2. Между изоформами наблюдалось большое соответствие в аминокислотном составе за исключением аминокислот с положительно и отрицательно заряженными радикалами – отношение (Glx + Asx) к (Lys + Arg) для Липазы I составило 3,2, для Липазы II – 2,2, что согласу ется с их изоэлектрическими точками.

Оптимальные условия действия изоферментов были следующими: темпе ратура 35 С и значение рН для Липазы I – 6,5;

для Липазы II – 6,0.

Определение функциональных групп липаз и расшифровка механизма их действия. Известны многочисленные исследования по расшифровке строения активного центра микробных липаз, особенностей механизма их действия, по верхностной активации. Для этого используются методы химической модифи кации, сайт-направленного мутагенеза, молекулярного моделирования. Уста новлено, что большинство липолитических ферментов действуют как серино вые гидролазы с триадой Ser-Gis-Asp в активном центре. Кислотный остаток аспарагиновой кислоты триады в гидролитических ферментах, катализирую щих расщепление сложных эфиров, может быть заменен глутаминовым, как показано при определении структуры липаз Geotrichum candidum, Candida rugosa. Однако липаза Burkholderia sp. является тиоловым ферментом, имею щим в активном центре цистеин. Наряду с этим обнаружена липаза из Mucor hiemalis f. hiemalis, каталитическая активность которой остается неизменной при воздействии как модификаторов серина, так и цистеина.

Для идентификации остатков аминокислот липаз Rhizopus oryzae 1403, участвующих в катализе, была проведена модификация ферментов специфич ными реагентами с привлечением кинетического анализа ингибирования.

Липаза I исследовалась в реакции гидролиза, в качестве субстрата был взят трибутирин. Начальная скорость определялась по накоплению свободных жир ных кислот в первые 7–10 мин.

Зависимость начальной стационарной скорости процесса от концентрации субстрата имеет вид уравнения Михаэлиса =k2·CS,0·CE,0 / (KM + CS,0), (1) где k2 – эффективная константа;

КМ – константа Михаэлиса;

СS,0 и СЕ,0 – начальная концентрация субстрата и фермента соответственно.

Зависимость (lg 1/k2, pH) позволила установить рК ионизирующихся групп фермента – рК1=5,2 и рК2=6,9. Первое значение близко к карбоксильной группе, второе – к гистидину. рК гистидина подтвердилась в эксперименте с фотоокис лением Липазы I, проведенного при рН 5,5–7,5 и температурах 25, 30, 40 С:

были получены значения рК=6,51, и теплоты ионизации Н=29,1 кДж/моль.

Однако инактивация ферментов в процессе фотоокисления в зависимости от температуры и рН может происходить как вследствие разрушения остатков гистидина, так и нарушения общей молекулярной структуры белка. Поэтому для выяснения роли остатков имидазола гистидина в функционировании Липа зы I её модифицировали диэтилпирокарбонатом (DEP), который может реаги ровать в белках с имидазолом гистидина и с ОН-группами тирозина. Для Липа зы I установлено увеличение светопоглощения при 242 нм, что указывает на взаимодействие DEP с гистидином;

при длине волны 278 нм, характерной для тирозина, уменьшение поглощения было крайне незначительным. Расчеты кон стант инактивации фермента при различных концентрациях ингибитора и пре образование значений в полулогарифмических координатах позволило устано вить, что порядок реакции, определенный по тангенсу угла наклона прямой (tg ) равен 1,05, что указывает на участие в реакции не более одного остатка гистидина (рис. 4).

Подтверждение участия карбоксильных групп в каталитическом действии Липазы I проведено с помощью 1-этил-3(3-диэтил-аминопропил)карбодиимид гидрохлорида (EDC) в присутствии этилового эфира глицина. Известно, что карбодиимиды способны реагировать с другими аминокислотными остатками.

Аминогруппу лизина можно исключить из-за ее высокого рК, который будет препятствовать реакции в условиях данного эксперимента.

а б - D 0, 0,45 -1, 242 нм 0, -1, 278 нм lgk 0, -1, 0, -1, 0, - 0, -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 0, 0 5 10 15 20 lg[DEP] Время, мин Рисунок 4 – (а) Спектры поглощения липазы, модифицированной DEP (2,5·10-3М);

(б) определение порядка реакции С тирозином и гистидином карбодиимиды образуют устойчивые к кислот ному гидролизу соединения. Но аминокислотный анализ модифицированного фермента показал, что количество этих остатков не изменяется. Установлено, что уменьшение скорости гидролиза трибутирина сильно зависело от концен трации водородных ионов (рис. 5), значение рК группы равнялось 5,0.

а б -0, -1, lg k ln v -1 -1, - -2, -3 4,6 4,8 5 5,2 5,4 5,6 5,8 6 6,2 6, 0 5 10 15 рН Время, мин Рисунок 5 – (а) Зависимость скорости гидролиза трибутирина Липазой I, модифицированной EDC при различных значениях рН: () 6,4;

() 6,0;

() 5,4;

() 4,6;

(б) определение рК модифицированной группы Если карбодиимиды реагируют с серином, как в случае с химотрипсином, то активность полностью восстанавливается гидроксиламином. Добавление к инактивированной Липазе I NH2OH не дало такого эффекта. Таким образом, полученные результаты позволяют утверждать, что за инактивацию Липазы I EDC отвечают именно карбоксильные группы. Отсутствие инактивации без эфира в реакционной среде и экранирование фермента субстратом свидетель ствовало об отсутствии внутримолекулярных взаимодействий, которые может вызывать EDC. При практически полной потере активности в данном ферменте модифицировалось 11 карбоксильных групп (рис. 6). При условии псевдо первого порядка реакции получили, что для проявления активности необходи мо не менее трех групп.

100 Количество включенного Gly v, % от исх.

20 0 0 5 10 15 20 Время, мин Рисунок 6 – Ингибирование Липазы I карбодиимидом и включение глици на в молекулу фермента Для выяснения механизма действия EDC на липазу были определены ки нетические параметры гидролиза трибутирина и триолеина. Vmax мало отлича лись на обоих субстратах;

KM на трибутирине увеличилось в 1,47, а на триоле ине – в 1,18 раз. Соответственно в большей степени на трибутирине уменьши лась каталитическая эффективность – в 2,8 раз против 2,15 на триолеине. Это приводит к выводу, что карбоксильные группы отвечают за создание активной конформации фермента при связывании с определенным субстратом.

Анализ кинетических параметров гидролиза трибутирина Липазой I, мо дифицированной различными ингибиторами, показал, что DEP вызывал уменьшение Vmax, n-хлормеркурибензоат (n-ХМБ) – реагент на сульфгидриль ные группы – увеличение КМ;

фенилметансульфонилфторид (PMSF) – специ фический ингибитор сериновых ферментов, и EDC приводили к изменению обеих констант Михаэлиса (табл. 5).

Таблица 5 – Изменения кинетических параметров реакции гидролиза трибути рина Липазой I в присутствии различных модификаторов Относительные величины, % Модификатор Vmax KМ Нативный фермент 100,0 100, DEP 39,5 98, EDC 52,1 145, PMSF 36,4 134, n-ХМБ 95,2 128, Это говорит о том, что в соединении фермента с субстратом участвует сра зу несколько областей молекулы фермента, каждая из которых имеет ключевые аминокислотные остатки и поэтому блокирование одной из групп может приве сти к искажениям конформации, что делает ее менее благоприятной для связы вания с субстратом и для диссоциации фермент-субстратного комплекса.

Для исследования роли остатка серина в катализе была проведена модифи кация липазы ингибиторами, которые являются аналогами субстратов – n гексил-этил-хлорофосфонатом и додецилсульфонатом и проведен кинетиче ский анализ ингибирования (рис. 7).

а б 0, 1/v0, мкМ мин мг 1/v0, мкМ мин мг 0, 0, 0, 0, - 0, - 0, 0,06 0, 0,04 0, 0,02 0, -1,00 -0,50 0,00 0,50 1,00 1,50 2, -1,20 -0,20 0,80 1, -1 - 1/[S]0, мМ 1/[S]0, мМ Рисунок 7 – Кинетические зависимости ингибирования Липазы I (а) n гексил-этил-хлорофосфонатом и (б) додецилсульфонатом в двойных обратных координатах;

() нативный фермент;

(), () с ингибиторами Исходя из трехстадийного механизма ферментативной реакции гидролиза ks k2 k (2) E + S ES EA E+P2, P были рассчитаны индивидуальные константы k2 и k3 из соотношений k2 k k cat, (3) k 2 k k, (4) KM KS k2 k Для фосфоната они были равны: k2=4,2 с-1 и k3=7,6, то есть в данном случае ингибировалась стадия ацилирования. Для сульфоната соотношение между константами было обратным – k2=18,5 с-1 и k3=3,2, что свидетельствует о подав лении стадии деацилирования.

При исследовании изоформ липаз в реакциях гидролиза триолеина и эте рификации олеиновой кислоты и глицерина обнаружены близкие потери актив ности под действием специфических ингибиторов (табл. 6). Поэтому можно утверждать, гидролиз и трансэтерификация являются обращением одного и то го же механизма.

Таблица 6 – Влияние ингибиторов на активность изоформ липаз Rh. oryzae 1403 в реакциях гидролиза и этерификации Остаточная активность, % Реакция DEP EDC PMSF Липаза I Гидролиз 32,41,5 48,22,4 29,81, Этерификация 33,81,6 46,72,2 30,51, Липаза II Гидролиз 48,72,4 32,21,6 67,33, Этерификация 47,52,2 31,51,5 68,93, Представленные данные по идентификации остатков аминокислот Липазы I и ингибированию обеих изоформ липаз согласуются с известным механизмом, который предполагает, что нуклеофильная атака на карбонильный углерод эфирной связи осуществляется остатком серина, активизированным через сеть водородных связей гистидином и аспарагиновой кислотой. Сложноэфирная связь разрывается и образуется промежуточный интермедиат – ацил-фермент.

Деацилирование происходит в результате нуклеофильной атаки молекул воды через формирование второго тетраэдрального промежуточного соединения. Ко гда липаза действует в среде с пониженной активностью воды, другие нуклео фильные группы являются конечными акцепторами ацила (в трансферазных реак циях).

Исследование субстратной специфичности липолитического комплекса Rhizopus oryzae 1403. Позиционную специфичность липаз оценивали по PSI (positional specifity index), вычисляемого по соотношению диацилглицеролов (DG, %), образующихся за 1 ч гидролиза триолеина:

1,2(2,3) DG 1,3DG PSI (5) 1,2(2,3) DG 1,3DG Полученные данные (табл. 7) позволяют отнести обе изоформы липаз Rhizopus oryzae 1403 к позиционно специфичным, так как согласно данной ме тодике cтрого 1,3-специфичные липазы имеют PSI +100, у неспецифичных ли паз значения PSI находятся в пределах от +30 до –20, к третьей группе относят несовершенные 1,3-специфичные липазы (т. е. скорее специфичные, чем неспе цифичные) с PSI от +80 до +70.

Таблица 7 – Определение позиционной специфичности липаз Rhizopus oryzae Массовая доля продуктов гидролиза, % Фермент PSI 1,2(2,3)-диацилглицеролы 1,3-диацилглицеролы Липаза I 9,76 ± 0,29 0,49 ± 0,01 +81, Липаза II 6,74± 0,38 0,13 ± 0,01 +92, Для определения специфичности липаз к строению жирнокислотного остатка использован метод, предусматривающий гидролиз метиловых эфиров жирных кислот, полученных из натуральных жиров, и расчет коэффициента K(FA):

FAP, (6) K ( FA) FAS где [FA]P и [FA]S – концентрации жирных кислот во фракциях свободных жирных кислот и их метиловых эфиров соответственно.

В качестве исходных субстратов были выбраны молочный и рыбий жир, льняное, горчичное и касторовое масла, имеющие характерный жирнокислот ный состав. Анализ полученных данных показал, что обе формы липазы Rhizopus oryzae 1403 проявляют предпочтительность к жирным кислотам со средней длиной цепи. Такая тенденция наблюдалась на всех маслах. В пределах длины углеводородной цепи 14–18 явно была выражена специфичность к нена сыщенным жирным кислотам с одной и двумя двойными связями (рис. 8).

(а) (б) 1,4 1, 1, 1, K(FA) K(FA) 0, 0,6 0, 0, 0, 0, 4:00 12:00 14:00 16:00 18:00 18:01 16:00 16:01 18:01 20:01 20:05 22: 4:0 12:0 14:0 16:0 18:0 18:1 16:0 16:1 18:1 20:1 20:5 22: Жирные кислоты Жирные кислоты Рисунок 8 – K(FA) для жирных кислот при гидролизе метиловых эфиров, полученных из молочного жира (а) и рыбьего жира (б) Липазой I () и Липазой II () Линоленовая кислота являлась менее предпочтительной, так же как и ри цинолевая. Это говорит о том, что наличие большого количества (больше двух) двойных связей и оксигруппы может создавать стерические помехи при соеди нении фермента с субстратом. Отмечено, что Липаза I имеет более выраженную специфичность.

Различия в скорости высвобождения олеиновой и масляной кислот соста вили у Липазы I – 4–5 раз, у Липазы II – 1,3–1,8 раза;

олеиновой и докозагекса еновой кислот – 21,1 и 4,7 раз соответственно. Такие различия в специфичности изоформ продуцента объясняют тот факт, что препарат липазы Г10Х способен к гидролизу широкого спектра природных жиров и масел.

Иммобилизация липазы и физико-химические свойства иммобилизованно го фермента. Для расширения возможностей биоконверсии липидов необходи ма иммобилизация липолитических ферментов, так как она не только позволяет многократно их использовать, но и увеличивает их стабильность в системах с органическими растворителями. Для иммобилизации липазы Rhizopus oryzae 1403 были выбраны носители, используемые в пищевой технологии – стиро сорб МЭР 100(ЦГ) и анионит АВ-17-2П. Установлено, что перспективным но сителем для фермента является стиросорб, так как эффективность связывания липазы с ним составила 57,3 %, с анионитом она не превышала 23 %.

Исследования адсорбции фермента на стиросорбе показали, что равнове сие устанавливается к 40 мин для белка и к 60 мин для активности. Таким обра зом, липаза со временем вытесняет другие белки с поверхности носителя;

ад сорбционный коэффициент составил 1,25. Установлена оптимальная темпера тура адсорбции – 30 С. Адсорбционные константы, полученные при различных рН, мало отличались. Это дало основание предположить, что определяющую роль в связывании липазы со стиросорбом играют гидрофобные взаимодействия.

Кинетика связывания липазы с носителем изучалась с помощью смешан ного уравнения Колмогорова, Ерофеева, Казеева, Аврами и Мампеля (КЕКАМ) =1–exp(–k·n), (7) где – степень преобразования ([А]/[А]max, в единицах активности);

k – константа скорости адсорбции;

n – специфический кинетический параметр.

Применение модели КЕКАМ позволило нам получить прямолинейные за висимости (рис. 9).

-0, - -1,5 - ln[-ln(1-)] -2, - -3, - -4, - 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 ln Рисунок 9 – Кинетические зависимости в координатах уравнения КЕКАМ для адсорбции липазы при различных температурах: (1) 30 С;

(2) 23 С;

(3) 4 С Значения констант для различных температур и энергии активации приве дены в табл. 8. Параметр n рассматривается как критерий, определяющий ход гетерогенных реакций. Значения n для белка были 0,91–0,97, а для липазы – больше единицы, что говорит о том, что скорость адсорбции фермента лимити руется взаимодействием с поверхностью сорбента. При различных температу рах значения n мало отличались, что свидетельствует о незначительном влия нии ее на механизм связывания.

Таблица 8 – Значения кинетических параметров и энергии активации для ад сорбции липазы Rh. oryzae 1403 на стиросорбе Еа, кДж·моль- n k, с Температура, С 4 1,19 23 1,15 23 17, 30 1,13 Низкая энергия активации говорит о высоком аффинном сродстве липазы Rh. oryzae 1403 к стиросорбу.

Таким образом, проведенные исследования показали, что для достижения максимальной сорбции липазы на стиросорбе ее нужно проводить при темпера туре 30 С и рН 6,5 в течение 60 мин.

Гидролитическая активность иммобилизованного фермента составила ед./г носителя, активность переэтерификации – 385 ед./г. Исследования влияния рН и температуры на каталитическую активность препарата показали, что оп тимумы его действия не отличаются от растворимой формы фермента – это рН 6,5 и 35 С.

Иммобилизованный препарат отличался более высокой устойчивостью в органических средах. Полярные растворители (этанол, ацетон, изопропанол) вызывали инактивацию растворимой липазы при 35 С за 0,5–2 ч, с то время как у иммобилизованной формы остаточная активность после 10 сут инкубации со ставляла 17–43 %. В неполярных растворителях (изооктан, гептан, гексан) она оставалась на уровне 98–95 % за тот же период (рис. 10).

Испытания препаратов липазы, лиофилизированных или иммобилизован ных из буферных растворов с различными значениями рН, показали, что опти мум их действия в органических растворителях остается неизменным и состав ляет 6,5. Таким образом, растворители не вносят искажений в состояние иони зации фермента при катализе.

Иммобилизованный препарат показал более высокую термостабильность.

Время потери 50 % активности у растворимой липазы составило при 40 С 72 ч, 50 С – 4 ч. У иммобилизованной липазы период «полужизни» увеличился вдвое. Особенно высокая термостабильность иммобилизованного препарата отмечена в реакциях этерификации в органической среде. Так, в реакции эте рификации в гексане при 50 С степень конверсии за 8 ч была выше на 10 % по сравнению с 35 С, длительность процесса сокращалась на 2 ч. В среде без рас творителя степень конверсии при 50 С не превышала 40 % к 2 ч, а затем сни жалась в связи с тепловой денатурацией фермента (рис. 11).

ЛА отн., % 0 2 4 6 8 Время экспозиции, сут Рисунок 10 – Стабильность (а) растворимой и (б) иммобилизованной липа зы при инкубации в органических растворителях при 35 С: () метанол, () этанол, () ацетон, () хлороформ, ( ) изопропанол;

() бутанол, () гексан, (+) гептан, (*) изооктан Степень относительной конверсии, % 0 2 4 6 Время, ч Рисунок 11 – Влияние температуры на этерификацию глицерина и олеино вой кислоты: () 35 С;

() 50 С ;

() 60 С ;

(, ) система без растворителя;

(,, ) в гексане.

Высокая активность и стабильность иммобилизованной липазы позволяет рекомендовать ее для биоконверсии жировых продуктов.

Глава 5. Исследование кинетических параметров реакций гидролиза и трансэтерификации ацилглицеролов, катализируемых липазой в водной и органической средах Различные типы превращений – как гидролиз, так и трансэтерификация триацилглицеролов под действием иммобилизованного препарата липазы Rh.

oryzae 1403 исследованы в водной среде и в системах с органическими раство рителями. Несмотря на то, что общие правила управления ферментативным ка тализом в таких нетрадиционных средах существуют, параметры для каждого фермента нельзя точно предсказать, поэтому они должны быть определены экспериментально.

Кинетические параметры гидролиза гомогенных триацилглицеролов Vmax и KM были определены с помощью метода двойных обратных координат Лай нуивера и Берка. Начальная скорость определялась по накоплению свободных жирных кислот. Полученные значения представлены в табл. 9.

Триацилглицеролы с высокой температурой плавления и находящиеся в твердом состоянии при оптимальной температуре действия липазы Rh. oryzae 1403, не подвергались превращениям. Поэтому их гидролиз был проведен в си стеме с растворителями с различной полярностью – гексаном (log P 3,5) и бута ноном (log P 0,28).

Таблица 9 – Кинетические характеристики гидролиза триацилглицеролов им мобилизованной липазой Rh. oryzae Vmax, Ммин-1г-1 Vmax /KM, г-1мин- Субстрат KM, М Без растворителя Трибутирин 505±30 810±52 0,62±0, Трикапроин 620±37 765±46 0,81±0, Трикаприлин 780±48 620±40 1,26±0, Трикаприн 910±54 510±28 1,78±0, Триолеин 1810±91 390±25 4,64±0, Трилинолеин 2030±110 350±20 5,80±0, Растворитель – гексан Трилаурин 1150±61 720±43 1,60±0, Тримиристин 1390±82 980±59 1,42±0, Трипальмитин 1520±91 1190±72 1,28±0, Тристеарин 1740±104 1450±87 1,20±0, Растворитель – бутанон Трилаурин 450±32 920±52 0,49±0, Тримиристин 720±45 840±48 0,86±0, Трипальмитин 890±54 680±10 1,31±0, Тристеарин 1020±67 610±35 1,67±0, С увеличением длины цепи жирной кислоты в составе ТАГ скорость гид ролиза возрастала вне зависимости от системы реакции. Характер изменения KM определялся полярностью среды реакции: в воде и бутаноне значения KM уменьшались с длиной цепи, а в гексане – увеличивались. Таким образом, в не полярном растворителе требуется преодолеть более высокий энергетический барьер для связывания субстрата с ферментом. Судя по константам скорости второго порядка – Vmax /KM, специфичность к кислотам с большой длиной цепи проявлялась в воде и полярном растворителе;

в неполярном растворителе наблюдалось обращение специфичности к длине цепи жирной кислоты. Эффек тивность гидролиза в бутаноне была ниже в 2,8–3,6 раз по сравнению с водной средой, что объясняется значительным снижением скорости реакции. Умень шение эффективности гидролиза триацилглицеролов в гексане главным обра зом связано с возрастанием константы Михаэлиса в 1,4–3,7 раз.

Исследования динамики гидролиза растительных масел липолитическим комплексом Rh. oryzae 1403 показали, что она отличается от таковой у позици онно специфичных липаз. В последнем случае при достижении 40 % гидролиза происходит выделение глицерина и его количество монотонно увеличивается.

Количество моноацилглицеролов в реакционной смеси при этом начинает уменьшаться. Как видно из рис. 12, глубина расщепления масла для препарата липазы Rh. oryzae 1403 не превышала 37 %, глицерин образовывался в следо вых количествах, что можно объяснить миграцией ацила в sn-2-положение ацилглицерина.

Количество продуктов, мол. % 0 20 40 60 80 Степень расщепления, % Рисунок 12 – Характер гидролиза растительных масел липазой Rh. oryzae 1403: () ТАГ;

() ДАГ;

() МАГ;

() СЖК;

(*) глицерин В рассматриваемой реакции ТАГ + Н2О ДАГ + СЖК (8) создающееся равновесие связано с особенными свойствами данного фермент ного препарата, а именно, с высокой трансацилирующей активностью.

Основным фактором, определяющим положение равновесия в рассматри ваемой реакции, является содержание воды в реакционной смеси. Изучение си стем без растворителей показало, что при увеличении количества воды ско рость гидролиза ТАГ монотонно возрастает, а для этерификации существует некоторый предел, выше которого скорость реакции снижается (рис. 13). При проведении процессов в среде с органическими растворителями вода в реакци онной системе распределяется между ферментом, носителем, растворителем, субстратами и продуктами реакции. Поэтому количество воды становится не корректным параметром. По этой причине в экспериментах по исследованию влияния растворителей на ход реакций трансэтерификации использовался пока затель активности воды aw.

а б -1 - -1 - v0, мкМ мин г v0, мкМ мин г 0 1 2 3 0 0,5 1 1,5 2 2, Количество воды в реакционной Количество воды в реакционной смеси, % смеси, % Рисунок 13 – Влияние количества добавленной воды на ход реакций гид ролиза триолеина (а) и этерификации глицерина и олеиновой кислоты (б), ката лизируемых иммобилизованным препаратом липазы Rh. oryzae Были испытаны растворители смешивающиеся и несмешивающиеся с во дой, с различной гидрофобностью, характеризуемой коэффициентом распреде ления log P: бутанон (0,28), дипропиловый эфир (1,9), бензол (2,0), гексан (3,5).

Зависимость скорости реакции этерификации от aw была подобна со всеми вы бранными растворителями;

максимальные ее значения наблюдались в диапа зоне aw 0,5–0,8 (рис. 14).

-1 - v0, мкМ мин г 0 0,2 0,4 0,6 0,8 aw Рисунок 14 – Скорость этерификации глицерина и олеиновой кислоты, осуществляемой липазой, как функция аw в системах с органическими раство рителями: () гексан;

() без растворителя;

() бензол;

() бутанон;

(*) бутанон Снижение скорости реакции при дальнейшем увеличении aw происходит прежде всего из-за конкуренции между гидролизом и алкоголизом промежу точного соединения – ацил-фермента.

При любой активности воды на скорость трансэтерификации оказывал влияние вид растворителя: в гексане она была выше по сравнению с реакцион ной системой без растворителя, а более полярные растворители приводили к ее снижению.

Осуществляемые липазой реакции биоконверсии ацилглицеролов, рас сматриваемые в настоящей работе, и различия косубстратных систем показаны в табл. 10. Они включают две полуреакции, в которых образуется тетраэдриче ский интермедиат.

Таблица 10 – Различия в косубстратных системах при биоконверсии ацилгли церолов Факторы, влияющие на скорость полуреакций Тип реакции Косубстраты Донор ацила+Е Ацил-Е+нуклеофил ацил-Е +Х ацил-нуклеофил +Е Этерификация СЖК, глицерин СЖК (Х=Н2О) Ацил-Е, глицерин Глицеролиз ТАГ, глицерин ТАГ (Х=ДАГ) Ацил-Е, глицерин, ДАГ Ацидолиз ТАГ, СЖК ТАГ, СЖК Ацил-Е, ДАГ (Х=Н2О, ДАГ) Переэтерификация ТАГ1, ТАГ2 ТАГ1, ТАГ2 Ацил-Е, ДАГ1, ДАГ (Х=ДАГ1, ДАГ2) Как можно ожидать, скорости этих реакций будут различными из-за раз личий в природе донора ацильной группы и нуклеофила.

Проведены сравнительные исследования реакций этерификации и глице ролиза в средах с полярным и неполярным растворителями при aw 0,83. В каче стве доноров ацила использовали олеиновую кислоту и триолеин соответствен но. На рис. 15 показаны зависимости начальной скорости этерификации от кон центрации олеиновой кислоты и глицерина.

Характер графиков в двойных обратных координатах (1/v0-1/[A]) свиде тельствует о пинг-понговом би-би-механизме реакции с конкурентным ингиби рованием одним из субстратов – акцептором ацила – глицерином. Ингибирова ния реакции этерификации олеиновой кислотой не было обнаружено. В этом случае механизм этерификации представляется следующей схемой:

P B A Q k k3 k-3 k- k2 k- k1 k- (9) Е F (EA FP) (FB EQ) Е k5 Ki ЕВ В k- б а v0, мкМ/мин г v0, мкМ/мин г 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 [Глицерин], мМ [C 18:1], мМ в 1, 1/v0, мкМ мин г 0, 0, - 0, 0, 0, 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1, - 1/[C 18:1], мМ Рисунок 15 – Влияние концентрации олеиновой кислоты (а) и глицерина (б) на скорость реакции этерификации в гексане: () 1 мМ;

() 2,5 мМ;

() мМ;

() 10 мМ;

(*) 20 мМ;

() 50 мМ;

(+) 100 мМ;

(в) зависимость в двойных обратных координатах Согласно этому механизму начальная скорость может быть описана урав нением Vmax [ A][ B ] v, (10) [ B] A B K M [ B ]1 B K M [ A] [ A] [ B ] K i A B где А и В – субстраты, донор и акцептор ацила соответственно;

K M и K M кинетические константы Михаэлиса при насыщении В и А;

KiB – константа ин гибирования для глицерина.

Установлено, что кинетическая модель реакций не зависела ни от типа до нора ацила, ни от вида растворителя.

Кинетические параметры, определенные согласно уравнению (9), пред ставлены в табл. 11. Значения Vmax в бутаноне составили 44–52 % от Vmax в гек сане, что может быть связано с непосредственным влиянием полярного раство рителя на фермент. В бутаноне было затруднено связывание с глицерином как ацил-фермента ( K M ), так и свободного фермента ( KiB ). В гексане связывание B свободного фермента с олеиновой кислотой ( K M ) и глицерином ( KiB ) было со A поставимо, а с триолеином – менее сильным.

Таблица 11 – Кинетические константы этерификации и глицеролиза, катализи руемых иммобилизованной липазой Rh. oryzae 1403 в бутаноне и гексане Растворитель Донор ацила, А Акцептор ацила, В A B Vmax, Vmax / K M Vmax / K M Донор Акцептор A B B K M, мМ мин-1·г-1 K M, мМ Ki, мМ мин-1·г- М/минг ацила ацила 10-3 10- Бутанон Глицерин Триолеин 705,6 3,70,3 191,1 493,4 764,5 1,40, С 18:1 Глицерин 462,5 8,50,5 5,40,3 271,2 865,4 1,70, Гексан Глицерин Триолеин 1609,6 361,9 4,40,6 5,90,7 181,5 27,12, С 18:1 Глицерин 885,4 131,1 6,80,6 10,30,8 221,9 8,50, Скорость реакции этерификации олеиновой кислоты и глицерина была ниже в 1,9–2,3 раза, чем трансэтерификации между глицерином и триолеином и в гексане, и в бутаноне. Отмечено изменение в субстратной специфичности, оцениваемой как отношение (Vmax /КМ ТАГ)/(Vmax /КМ С18:1) от гексана к бута нону в 5,3 раза. Каталитическая эффективность по отношению к глицерину бы ла значительно выше в гексане, чем в бутаноне.

Кинетика реакции ацидолиза в гексане исследована с точки зрения обра щения реакции гидролиза триолеина. Скорость реакции гидролиза в этом слу чае определялась по убыванию субстрата, а скорость ацидолиза по его образо ванию в реакции между диолеином и олеиновой кислотой. Определение кине тических констант проведено согласно уравнению скорости для пинг-понгового би-би-механизма без ингибирования субстратом, так как оно не наблюдалось.

Это уравнение имеет вид Vmax [ A][ B ], (11) v A B K M [ B ] K M [ A] [ A] [ B ] Кинетические константы гидролиза триолеина и синтеза диолеина и олеата приведены в табл. 12. Анализ полученных данных показал, что максимальная скорость гидролиза триолеина в 3,3 раза меньше, чем обратной реакции, но ка талитическая эффективность обеих реакций сравнимы, то есть для липазы Rh.

oryzae 1403 при выбранных условиях гидролиз не является скорость лимити рующей стадией при ацидолизе.

Таблица 12 – Кинетические константы гидролиза и ацидолиза Vmax/ K M А, каж Vmax, каж А B K M, мМ K M, мМ КМ, мМ Реакция мин-1·г-1 10- М/минг Гидролиз триолеина 158±11 2,7±0,2 58±4, Этерификация 517±35 8,5±0,5 61±3,9 48±3, Таким образом, установлено, что кинетические параметры реакций транс этерификации зависят от природы как донора ацила, так и его акцептора, а так же от присутствия растворителя и его полярности. Самая высокая каталитиче ская эффективность для иммобилизованной липазы Rh. oryzae 1403 отмечена в реакции ацидолиза, а наиболее предпочтительным растворителем является не полярный растворитель – гексан.

Глава 6. Практическое использование ферментативной конверсии природных триацилглицеролов 6.1. Гидролизованные жировые продукты и их функциональные свойства в технологии хлебопечения.

Продукты гидролиза жиров липазой Rh. oryzae 1403 – моно- и диацилгли церолы, жирные кислоты обладают поверхностно-активными свойствами. Про веденные исследования показали, что жиры, модифицированные ферментатив ным гидролизом, являются достаточно эффективными улучшителями качества хлебобулочных изделий. Увеличивался удельный объем, пористость, эластич ность мякиша, замедлялось черствение изделий. По органолептическим показа телям опытные образцы соответствовали требованиям нормативной докумен тации. Сокращалась длительность брожения теста в 1,4–1,5 раза.

С целью научного обоснования применения гидролизованного масла в технологии хлебопечения исследовано его влияние на жизнедеятельность дрожжевых клеток, свойства клейковины пшеничного теста и пшеничного крахмала при различной степени гидролиза и массовой доле масла.

При культивировании дрожжей на модельной синтетической среде уста новлено, что в присутствии гидролизованного масла в сравнении с нативным ускоряется потребление глюкозы дрожжевыми клетками (рис. 16). Подобный эффект получен с жирными кислотами – олеиновой и линолевой. Это может быть связано с повышением проницаемости мембран клеток и снижением за тормаживающего действия нативного масла на проникновение в них углеводов.

Гидролизованное масло способствовало повышению сопротивляемости клейковины нагрузке сжатия (рис. 17).

Решающую роль в получении такого эффекта играют жирные кислоты.

Они являются поверхностно-активными веществами с дифильным строением.

Адсорбируясь на межфазовой поверхности, такие соединения снижают поверх ностное натяжение, что эквивалентно образованию новой поверхности.

Для моделирования состояния крахмальной фракции муки в готовых хле бобулочных изделиях изучено влияние гидролизованного масла на процесс формирования крахмального студня по изменению его пластической прочности (рис. 18).

Остаточное количество глюкозы, % 0 45 90 Время, мин Рисунок 16 – Динамика потребления глюкозы дрожжевыми клетками в присутствии 5 % масла: гидролизованное масло (- - -) со степенью расщепле ния, (%): () 6,8;

() 9,6;

() 12,5;

() нативное масло;

() контроль – без масла, ед. шк.

ИДК деф.

Н 0 60 120 Время, мин Рисунок 17 – Влияние 5 % нативного масла и гидролизованного со степе нью расщепления () 6,8 %;

() 9,6 %;

() 12,5 % на свойства клейковины в процессе брожения;

() нативное масло;

() контроль Прочность крахмального студня была максимальной без масла и снижа лась по мере увеличения его концентрации. Очевидно, масло в этом случае вы полняет роль пластификатора, уменьшая энергию связи частиц и затрудняя ста билизацию структуры. Гидролизованное масло приводило к повышению проч ности крахмального студня. Вероятно, большая прочность создается за счет со здания комплексов амилозы и амилопектина с моно- и диацилглицеролами, ко торые, как известно, вызывают флокуляцию крахмальных зерен и увеличивают таким образом степень полимеризации студня. Таким образом, изменение свойств клейковины и крахмала под влиянием гидролизованного масла позво ляет стабилизировать физические свойства теста. Установлена рациональная степень гидролиза масел и жиров – 10–13 %.

Рk, МПа 0 60 120 Время, мин Рисунок 18 – Влияние 5 % нативного масла и гидролизованного со степе нью расщепления () 6,8 %;

() 9,6 %;

() 12,5 % на формирование крахмально го студня (б);

() нативное масло;

() контроль Установлено, что при хранении крахмальных студней в течение трех суток их пластическая прочность возрастала, но в образцах с гидролизованным мас лом этот процесс протекал медленнее. Это объясняет замедление черствение хлебобулочных изделий.

Более ощутимый эффект улучшения качества теста и хлеба получен при использовании совместного действия липазы и липоксигеназы. Это может быть достигнуто обработкой масла ферментными препаратами, полученными из раз ных продуцентов (Rhizopus oryzae 1403 и Rh. oryzae 605), либо комплексным препаратом из Rh. microsporus var. chinensis 1062 (табл. 13).

Таблица 13 – Показатели качества хлеба С комплекс С препаратами Традиционный С препаратом ным препара Наименование липазы липазы Rhizo- том из Rh. mi безопарный показателя и липоксигена pus oryzae 1403 crosporus var.

способ зы chinensis Влажность мякиша, % 43 43 43 Кислотность мякиша, град 2,4 2,5 2,5 2, Пористость, % 73 77 82 Удельный объем, см /100 г 280 304 323 Формоустойчивость, Н:Д 0,37 0,39 0,42 0, Аппаратурная и технологическая схемы приготовления теста с использо ванием модифицированного масла представлены на рис. 19, 20.

Рисунок 19 – Аппаратурная схема приготовления теста безопарным спосо бом с использованием масла, гидролизованного препаратом липазы: 1 – гомо генизатор;

2 – водомерный бачок;

3 – сепаратор;

4 – дозировочная станция;

5 – тестомесильная машина;

6 – нагнетатель теста;

7 – бункер для брожения теста;

8 – тестоделительная машина Масло:раствор фермента = 2:1;

Биомодифицированое перемешивание:

масло t = 30–32 С, 60 мин;

СЖК 5,6–5,8 % Дрожжевая Солевой Раствор суспензия раствор сахара Мука Вода Wт = 43,5 % ТЕСТО бр = 110 мин t бр = 28–30 С Рисунок 20 – Схема приготовления теста безопарным способом 6.2 Получение жировых продуктов с повышенным содержанием моно- и диацилглицеролов с помощью этерификации и глицеролиза.

Проведение этерификации глицерина и олеиновой кислоты при соотноше нии 1:1 в среде без растворителя показало, что моно- и диацилглицеролы обра зовывались почти в эквимолекулярных количествах. Формирование триолеина происходило очень медленно (рис. 21). Это можно объяснить позиционной специфичностью липазы, что подтвердилось результатами тонкослойной хро матографии продуктов этерификации: в начале процесса проявлялись 1(3) мо ноолеин и 1,3-диолеин. К 6 ч идентифицировались 1,2(2,3) диолеин, к 8 ч – 2 моноолеин, что связано со спонтанной миграцией ацила из первого положения молекулы глицерина во второе. За счет этого образовывался и триолеин.

Относительное количество продуктов, мол. % 0 2 4 6 8 Время, ч Рисунок 21 – Изменение состава продуктов этерификации глицерина и олеиновой кислоты: () олеиновая кислота;

() моноолеин;

() диолеин;

() триолеин Эффективность синтеза сильно зависела от количества воды в реакцион ной смеси. Лучший результат получен при содержании воды 2,5-3,0 %, при дальнейшем его увеличении степень конверсии снижалась, соотношение про дуктов при этом не изменялось. Для получения высоких концентраций продук тов в равновесии необходим избыток глицерина – лучший результат дало мо лярное отношение олеиновой кислоты и глицерина 1:3,1.

Исследован процесс глицеролиза различных масел и жиров в средах с ор ганическим растворителем и в его отсутствие. В качестве растворителя был вы бран 2-метил-2-пропанол. Факторы, влияющие на характер процесса, изучены на примере глицеролиза подсолнечного масла.

Процесс глицеролиза в системе без растворителя показан на рис. 22.

К 3 ч 74,3 % триацилглицеролов масла конвертировалось в моно- и диа цилглицеролы. Наблюдалось почти равное распределение между 1,3 и 1,2(2,3) диацилглицеролами. При более длительной инкубации – 8 ч – трансформирова лось до 97 мол. % триацилглицеролов;

моноацилглицеролы накапливались в количестве 68,7 мол. %. Диацилглицеролы составляли в сумме 26,1 мол. %.

Жирные кислоты появлялись в реакционной смеси начиная с 4 ч, в равновесном состоянии их количество находилось в пределах 2 %.

Продукты, мол. % 0 2 4 6 Время, ч Рисунок 22 – Глицеролиз подсолнечного масла в среде без растворителя:

() СЖК;

() МАГ;

() 1,2(2,3) ДАГ;

() 1,3 ДАГ;

() ТАГ Проведение глицеролиза в среде с растворителем при концентрации масла 20 % и глицерина 10 % показало, что процесс конверсии триацилглицеролов идет несколько медленнее, что, по всей вероятности, связано с влиянием рас творителя на активность фермента. Равновесное состояние отличалось соста вом продуктов от системы без растворителя: больше образовывалось моноа цилглицеролов – до 85,8 мол. % и, соответственно, меньше диацилглицеролов – 7,2 мол. % (рис. 23).

Продукты, мол. % 0 2 4 6 Время, ч Рисунок 23 – Глицеролиз подсолнечного масла в среде с 2-метил-2 пропанолом: () СЖК;

() МАГ;

() 1,2(2,3) ДАГ;

() 1,3 ДАГ;

() ТАГ На выход и состав конечных продуктов при глицеролизе сильно влияло соотношение субстратов – глицерина и масла. Причем наблюдалась различная картина в водной среде и в 2-метил-2-пропаноле (рис. 24, 25). Для получения максимального количества моноацилглицеролов в системе без растворителя опти мальное соотношение глицерина (как добавленного, так и в составе масла) и ацильных групп триацилглицеролов масла составило 1,6:1, дальнейшее его по вышение не приводило к изменению равновесного состояния в реакционной смеси. В 2-метил-2-пропаноле выход моноацилглицеролов повышался до из бытка глицерина в 2,7 раза к ацильным группам. Количество диацилглицеролов при этом соответственно снижалось.

Продукты, мол. % 0,5 1 1,5 2 2, Количество глицерина, г Рисунок 24 – Влияние количества глицерина на выход продуктов при гли церолизе подсолнечного масла в среде без растворителя: () СЖК;

() МАГ;

()ДАГ Продукты, мол. % 2,5 5 10 15 Концентрация глицерина, % Рисунок 25 – Влияние количества глицерина на выход продуктов при гли церолизе подсолнечного масла в 2-метил-2-пропаноле: () СЖК;

() МАГ;

()ДАГ Максимальный выход диацилглицеролов мог быть получен при низкой концентрации глицерина с соотношением (0,65–0,7):1 как в среде с растворите лем, так и без него.

Исследование влияния концентрации масла в органическом растворителе в пределах 10–50 % при постоянном количестве глицерина – 15 % показало, что лучший результат (по выходу моноацилглицеролов) в мол. % достигался при концентрации масла 15 %. По всей вероятности, это связано с более благопри ятным соотношением глицерина и ацильных групп (3,5:1). Технологическая схема производства жировых продуктов с повышенным содержанием моно- и диацилглицеролов приведена на рис. 26.

6.3 Получение низкокалорийных жиров путем ацидолиза.

Иммобилизованный комплексный препарат липазы Rh. oryzae 1403 являет ся перспективным для проведения ацидолиза. Установлено, что жирные кисло ты со средней молекулярной массой могут быть успешно включены в триа цилглицеролы растительных масел как в среде с растворителем, так и без него (рис. 27).

При дозировке препарата 10 % к массе субстратов и соотношении кислот к маслу 2:1 моль/моль равновесие устанавливалось к 12 ч и количество включен ных кислот от максимально возможного (66,6 %) для каприловой кислоты со ставило 54,7 и 59,6 и каприновой – 70,4 и 81,5 % соответственно в среде без растворителя и в гексане. Система с растворителем была несколько предпочти тельней. Однако в промышленности имеют преимущество технологии без рас творителей, так как их добавление усложняет процесс, повышает его стои мость;

выход продукта на единицу объема реакционной смеси значительно снижается.

Включение кислот, мол. % 0 2 4 6 8 Время, ч Рисунок 27 – Ацидолиз подсолнечного масла иммобилизованной липазой с кислотами: () каприновой;

() каприловой;

светлые значки – без растворителя;

темные значки – в органической среде В связи с этим был исследован ацидолиз различных растительных масел с каприновой кислотой в среде без растворителя. С целью достижения макси Растительное Глицерин, 14 % масло, 86 % Высушивание и деаэрация под вакуумом;

0,7–1,3 кПа;

105–115 С;

механическое перемешивание 30 мин Внесение катализатора;

Иммобилизованный атмосфера азота;

ферментный препарат механическое перемешивание Rh. oryzae Высушивание и деаэрация под вакуумом;

0,7–1,3 кПа;

33–35 С;

механическое перемешивание 15 мин Проведение реакции;

33–35 С;

механическое перемешивание;

6ч Ферментный Фильтрование препарат Подача пара;

Перегонка с паром Восстановленный начальная под вакуумом, 0,15–0,8 кПа;

глицерин температура 95 С 175 С;

1,5–2 ч Охлаждение под вакуумом, 0,15–0,8 кПа;

механическое перемешиваиние 60–90 С Жировой продукт:

ТАГ 3,1–4,0 % МАГ 33,7–74,6 %, ДАГ 58,8–21,6 % Рисунок 26 – Технологическая схема процесса производства жировых про дуктов с повышенным содержанием моно- и диацилглицеролов на основе фер ментативного катализа мального включения этой кислоты в триацилглицеролы масла была проведена оптимизация ацидолиза с использованием центрального ком-позиционного униформ-рототабельного планирова ния эксперимента. На основании предва рительной оценки в качестве факторов, оказывающих влияние на выход про цесса, были выбраны: дозировка ферментного препарата к массе субстратов (Е, %), соотношение масла и кислоты (С10:0:ТАГ, моль/моль), содержание воды в реакционной смеси (W, %) и длительность (). Реализация плана эксперимента и результаты расчетов эффектов факторов показали, что основную роль играет соотношение субстратов и содержание воды. Оптимальные параметры прове дения ацидолиза – Е= 11,3 %;

W=3,5 %;

кислота:масло (моль:моль) = 6,8 и вре мя 5 ч позволили повысить включение С10:0 до 60,6 мол. %, т. е. до 91,8 % от теоретически возможного. Сокращение длительности процесса в 2–3 раза по сравнению с известными технологиями дает увеличение прибыли в среднем в 3,3 раза и рентабельности продукции на 44,4 %. Газовая хроматография состава жирных кислот триацилглицеролов после ацидолиза показала, что с увеличени ем включения каприновой кислоты почти эквивалентно в них уменьшается ко личество других кислот (рис. 28).

Содержание жирных кислот, мол.

% 0 1 2 3 4 Время, ч Рисунок 28 – Изменение жирнокислотного состава подсолнечного масла при ацидолизе с каприновой кислотой: () С10:0;

() С18:1;

() С18:2;

(*) С16: Позиционная специфичность липазы Rh. oryzae 1403 сохранилась, о чем свидетельствовали данные жирнокислотных композиций в 1(3) и 2-положениях триацилглицеролов масла: во 2-ом положении она не изменилась после ацидо лиза, то есть каприновая кислота обменивалась с жирными кислотами только в 1-м и 3-м положениях ацилглицеролов (табл. 14).



Pages:   || 2 |
 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.